Методы для изучения липидных изменений в нейтрофилах и последующее образование нейтрофильных внеклеточных ловушек

Общая цель данного метода заключается в исследовании изменений липидного состава нейтрофилов при высвобождении внеклеточных ловушек нейтрофилов с помощью тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ. Этот метод может быть использован для получения более подробной информации о механизмах, которые участвуют в образовании нейтрофильных внеклеточных ловушек, или сокращенно названном образованием НВЛ. Основное преимущество этой процедуры заключается в том, что она предоставляет информацию о роли липидов в общей функции нейтрофилов с использованием простого для понимания протокола.

Выделение клеток, полученных из человеческой крови, будет продемонстрирована бывшей аспиранткой нашей лаборатории Арианой Нейман. А помогать ей будет Фридерика Ройнер. Подготовку клеток к анализу липидов продемонстрируют Грэм Брогден, постдок в моей лаборатории, и Диаб Хусейн, студент магистратуры по программе биохимии.

Для выделения нейтрофилов, полученных из крови человека, нанесите слой примерно 20 мл крови на 20 мл раствора диатризоата/декстрана натрия вблизи пламени, не смешивая. Центрифуга в течение 30 минут при 470 перегрузках g без торможения. Крайне важно не смешивать кровяную фазу с плотностью в растворе.

После этапа центрифугирования плюс мононуклеарные клетки нужно аккуратно удалять, чтобы избежать загрязнения или неспецифической активации клеток. Удалите мононуклеары и желтоватый слой плазмы. Перенесите полиморфноядерную клетку, или фазу PMN, в новую пробирку объемом 50 мл и заполните ее до 50 мл 1X фосфатным буфером.

Центрифугировать образец в течение 10 минут при 470-кратном g с торможением. Затем удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл стерильной воды на пять секунд для лизирования эритроцитов. Немедленно заполните пробирку до 50 мл 1X PBS и центрифугируйте образец.

После удаления надосадочной жидкости гранула должна стать белой. Если он по-прежнему красный, повторите эти действия. Затем повторно суспендируйте гранулу в 1000 микролитрах Roswell Park Memorial Institute, или среде RPMI.

Посчитайте количество клеток с помощью окрашивания Trypan Blue и гемоцитометра под световым микроскопом. Приготовьте клеточную суспензию в RPMI в концентрации два миллиона клеток/мл. Примерно 25 миллионов нейтрофилов могут быть собраны из 20 мл крови.

Для фармакологической обработки нейтрофилов для липидного анализа используют 15 миллионов подготовленных клеток. Инкубируйте образцы в реакционных пробирках в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После центрифугирования из образцов удаляют надосадочную жидкость и повторно суспендируют клеточную гранулу в 300 микролитрах HBSS.

После повторного центрифугирования образца с теми же параметрами повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл раствора хлороформ:метанол в соотношении 1:1. Затем гомогенизируйте повторно суспендированную гранулу с помощью канюли 26 калибра, проталкивая образец внутрь и из шприца объемом 1 мл 10 раз. Чтобы выделить липиды из нейтрофилов периферической крови человека, возьмите подготовленные нейтрофилы и поместите их на лед.

Наведите нейтрофилы пипеткой в стеклянную пробирку объемом 15 мл с завинчивающейся крышкой и уплотнением из ПТФЭ и гомогенизируйте их, встряхивая в течение одной минуты. Затем добавьте 2 мл метанола, а через минуту — 1 мл хлороформа. Встряхнув еще одну минуту, вращайте стеклянные трубки при комнатной температуре и 50 об/мин в течение 30 минут.

Далее гранулируют белковую фракцию, центрифугируя раствор при температуре 7 градусов Цельсия и 1,952 раза г в течение 10 минут. Осторожно сцедите надосадочную жидкость в новую стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл, оставив гранулу, содержащую белок. Храните гранулы при температуре 20 градусов Цельсия для будущего количественного анализа.

Добавьте 1 мл хлороформа и подождите одну минуту. Затем добавьте 1 мл дважды дистиллированной воды и переверните стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой с образцом на 30 секунд. После центрифугирования образца, как и раньше, удалите и отбракуйте верхнюю фазу вплоть до мутного слоя, но не включая его.

Высушите образцы в вакуумном концентраторе при температуре 60 градусов Цельсия и храните их при температуре 20 градусов Цельсия до тех пор, пока не потребуется. Для начала залейте до 5 мл каждого раствора в соответствующую стеклянную камеру. Добавьте любой вид фильтровальной бумаги, чтобы увеличить скорость работы в каждой камере.

Предварительно инкубируйте стеклянную пластину 20x10 см HPTLC из силикагеля 60 в первом рабочем растворе. Как только проточный раствор достигнет верхней части пластины, высушите его в течение 10 минут при температуре 110 градусов Цельсия. Растворите липидную гранулу, ранее полученную после сушки вакуумным концентратором, в нужном объеме 1:1 раствор хлороформ:метанол, и выдержите в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия до растворения.

Далее с помощью линейки и мягкого карандаша отметьте места загрузки для желаемого количества образцов плюс хотя бы один эталон. Отметьте дистанцию бега примерно на 4 см для первого решения для бега и примерно на 6 см для второго решения для бега. Чтобы загрузить образцы, трижды промойте шприц объемом 10 микролитров в соотношении хлороформ:метанол 1:1 перед загрузкой каждого нового образца.

Загружайте по 10 микролитров каждого образца по каплям, стараясь сконцентрировать образец на как можно меньшей площади. Поместите пластину вертикально в первую камеру с рабочим раствором. Убедитесь, что пластина параллельна стенке стеклянной камеры для достижения равномерной скорости миграции.

Следите за тем, чтобы пластины располагались параллельно задней стенке стеклянных камер и чтобы фронты растворителей не проходили слишком далеко, чтобы обеспечить эффективное разделение липидов. Как только линия растворителя достигнет первой отметки, снимите пластину, высушите ее и поместите во второй раствор. Повторите аналогичные действия для второго и третьего запущенных решений.

Оставьте пластину в растворе до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет верхней части пластины. Затем снимите тарелку, и просушите ее при комнатной температуре в течение одной минуты. Поместите пластину в раствор медного купороса на семь секунд.

После тщательной просушки тарелки выпекаем ее в духовке в течение семи минут при температуре 170 градусов Цельсия. Достаньте тарелку из духовки и дайте ей остыть. Чтобы выполнить ВЭЖХ, прикрепите колонку к защитному картриджу на инструменте, и нагрейте его до 32 градусов Цельсия.

Используйте метанол в качестве подвижной фазы при расходе 1 мл в минуту и давлении 65 бар. Установите УФ-детектор на 202 нанометра, чтобы количественно определить количество холестерина в каждом образце. Тщательно промойте аппарат ВЭЖХ перед анализом образцов и установите стандартную кривую холестерина, как описано в текстовом протоколе.

Наконец, повторно суспендируйте образцы в 500 микролитрах хлороформа:метанола 1:1 в стеклянных бутылках янтарного цвета объемом 1,5 мл с завинчивающимися крышками из красного ПТФЭ / белого силикона перед загрузкой их на прибор для ВЭЖХ. Здесь показан липидный профиль нейтрофилов на планшете HPTLC. Липиды можно идентифицировать путем сравнения расстояний миграции с нормой.

Также показана хроматограмма ВЭЖХ, показывающая два больших пика. Первый пик незадолго до двух минут – хлороформ. Второй большой пик через пять минут – холестерин.

Здесь показаны стандартные кривые холестерина, определенные с помощью ВЭЖХ и ВЭЖХ. Стандартная кривая, полученная с помощью ВЭЖХ, является линейной в более широком диапазоне концентраций по сравнению со стандартной кривой ВЭЖХ. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять нейтрофилы, полученные из крови человека, и впоследствии анализировать их липидный состав.

При проведении этой процедуры важно не забывать надевать нитриловые перчатки для защиты рук от опасного воздействия хлороформа:метанола, а также работать под вытяжным шкафом. Будущие эксперименты предоставят дополнительную информацию о механизмах образования НВЛ и общих функциях нейтрофилов, которые до сих пор не до конца изучены. Не забывайте, что работа с первичными клетками, полученными из крови человека, требует этического разрешения, а также соответствующих мер предосторожности, таких как работа в соответствующей лаборатории биобезопасности, чтобы избежать риска заражения человеческими патогенами.

Наконец, целью нашего исследования является поиск новых терапевтических мишеней против инфекции на основе врожденной иммунной системы, и особенно липидный состав очень интересен для нас, поскольку он поможет нам понять, почему нейтрофил действует антимикробно против инфекции.