Инструменты для изучения роли архитектурного белка HMGB1 в обработке Helix искажающие, Сайт-специфическая ДНК Interstrand сшивок

Общей целью экспериментов по иммунопреципитации модифицированного хроматина и суперспирализации ДНК является изучение ассоциации и последующих топологических модификаций, индуцированных архитектурными белками, на сайт-специфические повреждения ДНК, вызванные химиотерапевтическими или канцерогенными агентами в клетках человека. Эта методология позволит нам решить ключевые вопросы о повреждении и репарации ДНК, что должно способствовать открытию новых фармакологических мишеней для терапии рака. Наша технология позволяет нам направлять сайт-специфичные повреждения ДНК и облегчает оценку критических процессов репарации ДНК, связанных с раком человека.

Для начала, за 24 часа до трансфекции, поместите 400 000 клеток млекопитающих на 60-миллиметровую чашку в DMEM, дополненную 10% FBS без антибиотиков. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе в течение ночи. В 14-миллилитровой пробирке с круглым дном смешайте 30 микролитров трансфекционного средства комнатной температуры с 500 микролитрами питательной среды 1X, нагретой до 37 градусов Цельсия.

Во второй пробирке соедините два микрограмма TFO-направленных ICL-содержащих плазмид в 500 микролитрах питательной среды 1X. Инкубируйте трубки при комнатной температуре в течение 10 минут. Соедините первую смесь со второй смесью и пипеткой вверх и вниз, чтобы полностью перемешать.

Затем инкубируйте раствор при комнатной температуре в течение 25 – 30 минут. Далее используйте теплый PBS для двукратной промывки клеток. Затем добавьте трансфекционную смесь по каплям, равномерно распределяя раствор по всей пластине клеток.

Добавьте в тарелку один миллилитр питательной среды, и доведите итоговый объем до двух миллилитров. Хорошо перемешайте и поместите культуральные пластины при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через четыре часа замените среду тремя миллилитрами питательной среды с 10% FBS и инкубируйте еще 16 часов.

После инкубации добавьте в ячейки по 80 микролитров свежего 37%-ного формальдегида на тарелку, и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут. Угасите формальдегидную сшивку, добавив 300 микролитров охлажденного глицина на тарелку, и выдерживайте в течение пяти минут. Затем удалите среду, и используйте охлажденный PBS для мытья тарелок дважды.

Затем, добавив один миллиметр охлажденного PBS, соберите клетки, соскребая их в микроцентрифужную пробирку на льду, постоянно держа образцы на льду. Приготовьте гранулы ячеек центрифугированием при 13, 400-кратном перегрузке и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем удалите надосадочную жидкость, а гранулы положите на лед.

Используйте один миллилитр охлажденного буфера А для равномерного повторного суспендирования гранул и инкубируйте на льду в течение 10 минут. Затем гранулируйте ячейки, как и раньше. Теперь с помощью одного миллилитра охлажденного буфера B равномерно повторно суспендируйте гранулы и инкубируйте на льду в течение 10 минут, время от времени перемешивая путем инвертирования.

Затем гранулируйте ячейки, как и раньше. После повторного суспендирования клеток, в 200 микролитров охлажденного буфера В, добавьте два микролитра микрококковой нуклеазы, или МНазы, и инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем остановите реакцию MNase, поместив пробирки на лед и добавив 40 миллимоляров ЭДТА.

Уровень переваривания микрококковыми нуклеазами очень критичен, потому что переваривание может привести к потере сигнала, в то время как недостаточное переваривание может вызвать большое количество неспецифического фона. После гранулирования клеток повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах иммунопреципитации хроматина, или буфера ChIP, дополненного коктейлем ингибиторов протеазы. Затем перенесите клеточную суспензию в тонкостенную микроцентрифужную пробирку.

Просните образцы ультразвуком, поместив их на водяную баню в течение 20 секунд, а затем 20 секунд на лед. Повторите шаги ультразвуковой обработки девять раз, чтобы получить примерно от 800 до 1 200 фрагментов пар оснований. К 20 микролитрам обработанных ультразвуком образцов добавьте три микролитра пяти моляров натрия хлорида и один микролитр РНКазы А.Вихревой пробирки и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Затем добавьте два микролитра протеиназы К, и инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия в течение двух часов. После очистки образцов, согласно текстовому протоколу, запустите их на 1%-ном агарозном геле, и визуализируйте с помощью бромида этидия. В три отдельные, предварительно охлажденные силиконизированные пробирки добавьте 30 микролитров лизата и 70 микролитров охлажденного буфера 1X ChIP с добавлением ингибиторов протеазы.

Добавьте один микрограмм антител против IgG, антигистона H3 или анти-HMGB1 в соответствующие пробирки. Инкубировать в течение ночи в холодном помещении с непрерывной ротацией. В холодильной камере, после повторного суспендирования гранул белка G, добавьте четыре микролитра гранул в каждую реакционную пробирку и инкубируйте в холодной комнате с вращением еще два-четыре часа.

Поместите трубки на магнитную решетку, чтобы гранулировать шарики, и удалите надосадочную жидкость. Добавьте в гранулы 200 микролитров 1X ChIP буфера с коктейлем ингибитора протеазы, и постирайте на холоде с вращением в течение пяти минут. Далее, с высоким содержанием соли в буфере 1X ChIP, выполните дополнительную промывку.

Затем используйте 160 микролитров элюирующего буфера для повторного суспендирования гранул и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с вращением в течение 30 минут. Гранулируйте шарики, а надосадочную жидкость соберите в свежую пробирку. Добавьте шесть микролитров пяти моляров хлорида натрия и два микролитра протеиназы К и инкубируйте в течение ночи при температуре 65 градусов Цельсия.

После очистки ДНК, согласно текстовому протоколу, проводят ПЦР-реакции с использованием наборов праймеров к интересующему участку или областям, а растворяют продукты на 1%-ном агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Перед применением разморозьте на льду заранее приготовленный буфер для синтеза репарации ДНК, и добавьте 40 миллимолярного фосфокреатина, и 2,5 мкг креатинфосфокиназы. После приготовления 10X supercoiling buffer, согласно текстовому протоколу, используйте один микролитр vaccinia topoisomerasa 1 с 1X supercoiling buffer в реакции 10 микролитров для линеаризации 300 нанограммов суперспиральной плазмиды, PCA FG1.

К расслабленным плазмидам добавьте 25 микролитров только что размороженного клеточного экстракта HeLa и буфер для синтеза ДНК. Хорошо перемешайте, затем добавьте в реакцию один микролитр топоизомеразы коровьей оспы 1, и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Завершите реакции, добавив 1% SDS и 0,25 мг на миллилитр протеиназы К, и инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия в течение двух часов.

После литья 1%-ного агарозного геля с 1X TPE-буфером добавьте в реакции краситель, загружающий ДНК, и загрузите образцы непосредственно на гель на расстоянии не менее четырех дорожек друг от друга. Запустите гель в течение восьми-десяти часов при напряжении 2 вольта на сантиметр в 1X TBE для первого измерения при комнатной температуре, чтобы разрешить топоизомеры. Приготовьте два литра 1X TBE с тремя микрограммами на миллилитр хлорохинфосфата.

Замочите гель в 200 миллилитрах раствора, покрытом алюминиевой фольгой на 20 минут. Чтобы электрофорировать гель во втором измерении, поверните гель на 90 градусов по часовой стрелке и проведите его в течение четырех-шести часов при напряжении 2 вольта на сантиметр в хлорохиине, содержащем 1X TBE, чтобы разрешить положительные и отрицательные суперспирали. Количество хлорохина в буфере для электрофореза и в геле очень критично, так же как и работа геля при очень низком напряжении для второго измерения очень важна для разделения положительной и отрицательной суперспиралей.

После окрашивания и задержания геля, согласно текстовому протоколу, используйте тепловизор для визуализации термораспределения топоизомеров. Как видно на примере этого геля, примерно 79% плазмид, содержащих TFO-направленные ICL, мигрируют с меньшей подвижностью через матрицу агарозного геля по сравнению с несшитыми контрольными плазмидами. Анализы ChIP, проведенные на лизатах клеток U2OS человека, трансфицированных либо контрольной плазмидой, либо плазмидами, содержащими TFO-направленные ICL, показывают обогащение HMGB1 в области P-ICL по сравнению с контрольной областью при иммунопреципитации антителами против HMGB1.

Когда HMGB1 был истощен из клеток с помощью обработки миРНК, специфическое обогащение P-ICL уменьшалось. При иммунопреципитации одних и тех же образцов с использованием антител к IgG обнаруживалась минимальная амплификация ПЦР. Наконец, на этом рисунке двумерный электрофорез в агарозном геле демонстрирует архитектурную модификацию TFO-направленных ICL-содержащих плазмид в виде отрицательной суперспирализации HMGB1 в экстрактах клеток HeLa.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за пять дней, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру очень важно помнить, что все стирки должны проводиться в холодном помещении, так как стирки комнатной температуры могут усилить фоновый сигнал. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как истощение белка, опосредованного миРНК, с последующим анализом скрининга мутаций, чтобы ответить на такие вопросы, как: участвует ли представляющий интерес белок в репарации ДНК?

Или это существенно изменяет спектры мутаций в процессе? Этот метод проложил путь к изучению связи между белками и сайт-специфическими повреждениями ДНК. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как изучать ассоциацию архитектурных белков с целевыми поперечными связями ДНК, а впоследствии, определять влияние такой ассоциации на топологию ДНК.

Не забывайте, что работа с бромидом этидии может быть крайне опасной, поэтому во время проведения этого эксперимента всегда следует надевать надлежащую защитную экипировку.