Визуализация Charcoal Agar резазурин Пробирной для полуколичественного, средне-пропускной Перечень микобактерий

Общая цель CARA заключается в обеспечении среднепроизводительной полуколичественной оценки активности соединений в отношении реплицирующих и нереплицирующих микобактерий. Основным преимуществом данной методики является то, что в качестве суррогата КОЕ CARA позволяет быстро протестировать дозо- и временную зависимость действия соединения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области разработки противотуберкулезных препаратов, такие как определение того, является ли соединение бактериостатическим или бактерицидным в отношении реплицирующих бактерий, а также проявляет ли оно бактерицидную активность в отношении нереплицирующих бактерий.

Метод продемонстрирует Джулия Робертс, сотрудник нашей лаборатории. Добавьте 450 milliliters воды в стеклянный стакан объемом один литр или 900 milliliters воды в колбу Эрленмейера объемом два литра. Поместите в стакан или колбу магнитный перемешиватель, подходящий для автоклавирования.

Затем добавьте порошок Middlebrook 7H11, активированный уголь до конечной концентрации 0,4% и 50% раствор глицерина до достижения конечной концентрации 0,2%. Закройте горлышко колбы или стакана алюминиевой фольгой и закрепите ее на стекле автоклавировочной лентой. После автоклавирования среды охладите ее примерно до 55–65 °C на магнитной мешалке, установленной на низкую скорость, чтобы поддерживать уголь во взвешенном состоянии.

Работая в асептических условиях в боксе биологической безопасности, оснащенном магнитной мешалкой, снимите фольгу со среды и добавьте 100 или 50 миллилитров добавки OADC в колбу объемом два литра или стакан объемом один литр соответственно, продолжая перемешивание. Используя многоканальный дозатор с восемью или 12 фильтрующими наконечниками, заполните 96-луночный микропланшет, добавляя по 200 микролитра 7H11-OADC-charcoal из резервуара с реагентом или стакана; работайте быстро, чтобы избежать затвердевания агара и образования пузырьков. Поместите стопки микропланшетов CARA в зип-пакеты, чтобы предотвратить высыхание, и храните их при температуре четырех градусов Цельсия.

Инокулируйте полипропиленовые центрифужные пробирки с круглым или коническим дном, содержащие 4 или 20 мл соответственно сред и Middlebrook 7H9-ADN или 7H9-OADC, культурой M.smegmatis до OD580 от 0,01 до 0,1. Инкубируйте культуры M.smegmatis при 37 °C и 20% O2 с перемешиванием до достижения средней логарифмической фазы роста или приблизительного значения OD580 равного 0,5. Для постановки эксперимента по определению минимальной ингибирующей концентрации в условиях репликации и отсутствия репликации распределите по 200 µL клеток в среде 7H9-ADN с OD580 равной 0,01 во все лунки 96-луночного планшета с прозрачным дном, обработанного для культивирования тканей.

Для проведения анализа нереплицирующихся клеток дважды промойте клетки с использованием PBS, содержащего 0,02% tyloxapol. Для повторного суспендирования клеток используйте среду для нереплицирующихся клеток. Разведите клетки в среде для нереплицирующихся клеток до значения OD580, равного 0,1, и добавьте нитрат натрия из свежеприготовленного 1-молярного стокового раствора до конечной концентрации от 0,5 до 5 миллимоляр.

Распределите по 200 µL клеток с OD580 равной 0,1 по всем лункам 96-луночного планшета с прозрачным дном, прошедшего обработку для культивирования тканей. После приготовления тестовых агентов согласно текстовому протоколу добавьте 2 µL первого тестового агента в ряды с A по E и 2 µL второго тестового агента в ряды с E по H, затем тщательно перемешайте. Для проведения повторных анализов инкубируйте микропланшеты с M.smegmatis при 37 °C, 20% O2 и 5% CO2 от 1 до 48 часов.

В те моменты времени, когда CARA будет использоваться для считывания показателей, используйте многоканальный дозатор p200, установленный на 50–75 мкл, чтобы осторожно ресуспендировать содержимое лунок планшета для анализа в стиле MIC90, выполнив пяти-десятикратное перемешивание путем всасывания и вытеснения жидкости. Затем с помощью наконечников дозатора аккуратно перемешайте содержимое лунок круговыми движениями. Перенесите 10 мкл неразбавленного содержимого лунок анализа в соответствующие лунки микропланшета CARA, избегая разбрызгивания при переносе и следя за тем, чтобы аликвота объемом 10 мкл была нанесена точно в центр лунок микропланшета CARA.

С помощью специальной ленты закрепите стопки микропланшетов CARA, а затем поместите их в пластиковый пакет с зип-замком. Инкубируйте микропланшеты CARA с M.smegmatis при 37 °C и 20%O2 в течение одного-двух дней для репликационных планшетов и двух-трех дней для нерепликационных планшетов. Когда в лунках отрицательного контроля появится пленка бактериального роста или крупные макроскопические колонии, используя один набор из 12 наконечников p200 для многоканального дозатора, внесите 40 µL стерильного PBS вдоль стенок лунок, позволяя PBS распределиться по поверхности агара/бактериальных микроколоний.

Приготовьте проявитель CARA, смешав 5 mg резазурина и 50 mL 5% Tween80 в PBS. Добавьте 50 µL свежеприготовленного проявителя CARA в каждую лунку микропланшета CARA. Затем несколько раз покачайте планшеты вперед-назад, чтобы помочь распределению реагента по агару и бактериальному мату в каждой лунке.

Поместите планшеты в пластиковый пакет с застежкой и инкубируйте при 37 °C в течение не менее 30 минут для M.smegmatis. Перед измерением флуоресценции поместите микропланшеты CARA в бокс биологической безопасности на 15 минут при комнатной температуре, сняв крышки. При использовании спектрофотометров уровня BSL3 вне бокса биологической безопасности наклейте на планшет оптическую PCR-наклейку и плотно зафиксируйте ее, осторожно прижав поверхность наклейки мягким бумажным полотенцем.

Определите флуоресценцию с помощью верхнего считывания при длине волны возбуждения 530 нанометров и длине волны эмиссии 590 нанометров. Обнуление планшета не требуется. Для анализа данных постройте график, где по оси X отложена концентрация ингибитора в логарифмическом масштабе (log10), а по оси Y — флуоресценция в линейном масштабе.

Дополнительные сведения приведены в текстовом протоколе. Концентрация исследуемого агента, при которой флуоресценция CARA не поднимается выше фонового уровня, представляет собой CARA-MBC ≥ 99, показанную здесь. Индекс ≥ 99 указывает на то, что CARA-MBC дает расчетную концентрацию исследуемого агента, которая обеспечивает гибель бактерий на уровне ≥ 2 log10.

Предполагается, что соединения оказывают постантибиотический эффект, если они демонстрируют «статическое окно», определяемое как сдвиг вправо более чем в четыре раза между кривыми МПК и CARA. Статическое окно указывает на то, что молекула, активная против реплицирующихся M.tuberculosis, может быть бактериостатической, а не бактерицидной. Для молекул с выраженным постантибиотическим эффектом статические окна может быть трудно заметить; они становятся очевидными только после изучения расширенной оси Y для флуоресценции CARA, как показано здесь.

Здесь представлены результаты тестирования реплицирующих и нереплицирующих активных молекул с помощью методов MIC90 и CARA. Хотя согласно анализу MIC90 изониазид и линезолид проявляют активность против нереплицирующих бактерий, CARA показывает, что они неактивны в протестированных условиях отсутствия репликации. В данном эксперименте CARA воздействие на M.smegmatis возрастающими концентрациями рифампицина выявило эффект уже через один час и продемонстрировало нарастающую бактерицидную активность в интервале от 3 до 24 часов, при этом к 24 часам при концентрации примерно 10 µg/mL наблюдалось подавление на уровне ≥ 2-3 log10.

После освоения данной методики подготовка планшетов занимает примерно два часа, перенос клеток в планшеты CARA — менее часа, а проявление и измерение флуоресценции планшетов CARA при правильном выполнении — примерно от одного до двух часов. При выполнении данной процедуры важно помнить, что CARA используется как прогностический анализ для определения того, обладает ли соединение бактерицидной или бактериостатической активностью в отношении реплицирующих или нереплицирующих микобактерий. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как организовать CARA и проанализировать данные таким образом, чтобы помочь предсказать тип активности соединения.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.