Визуализация Charcoal Agar резазурин Пробирной для полуколичественного, средне-пропускной Перечень микобактерий

Общая цель CARA заключается в том, чтобы обеспечить полуколичественную оценку активности соединений в отношении реплицирующихся и нереплицирующихся микобактерий со средней пропускной способностью. Основное преимущество этого метода заключается в том, что в качестве суррогата КОЕ CARA позволяет быстро проверить зависимость соединения от дозы и времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области разработки лекарств от туберкулеза, такие как определение того, является ли соединение бактериостатическим или бактерицидным против реплицирующихся бактерий и является ли оно бактерицидным против неразмножающихся бактерий.

Демонстрировать метод будет Джулия Робертс, сотрудник нашей лаборатории. Добавьте 450 миллилитров воды в литровый стеклянный стакан или 900 миллилитров воды в двухлитровую колбу Эрленмейера. Положите в стакан или колбу автоклавируемую мешалку.

Затем добавьте порошок Middlebrook 7H11, активированный уголь до 0,4% конечной концентрации и 50% раствор глицерина для достижения 0,2% конечной концентрации. Закройте отверстие колбы или стакана алюминиевой фольгой и приложите к стеклу автоклавным скотчем. После автоклавирования среды охладите ее примерно до 55–65 градусов Цельсия на магнитной мешалке, установленной на низкую скорость, чтобы древесный уголь оставался во взвешенном состоянии.

Во время асептической работы в биозащитном колпаке с магнитной мешалкой снимите фольгу со среды и добавьте 100 или 50 миллилитров добавки OADC в двухлитровую колбу или однолитровый стакан соответственно и продолжайте перемешивать. С помощью многоканальной пипетки с восемью или 12 фильтрующими наконечниками заполните 96-луночный микропланшет 200 микролитрами древесного угля 7H11-OADC из резервуара с реагентом или стакана, работая быстро, чтобы избежать затвердевания агара и образования пузырьков. Поместите стопки микропланшетов CARA в закрывающиеся пластиковые пакеты, чтобы избежать высыхания, и храните их при температуре четыре градуса Цельсия.

Инокулировать полипропиленовые центрифужные пробирки с круглым дном или конические центрифуги, содержащие соответственно четыре или 20 миллилитров Middlebrook 7H9-ADN или 7H9-OADC с M.smegmatis с наружным диаметром 580 от 0,01 до 0,1. Инкубируйте культуры M.smegmatis при температуре 37 градусов Цельсия и 20% O2 при встряхивании, расширяя культуры до фазы среднего логарифма или приблизительного OD580 0,5. Чтобы провести эксперимент с минимальной ингибиторной концентрацией в реплицирующихся и нереплицирующихся условиях, распределите 200 микролитров клеток в 7H9-ADN с OD580 0,01 во все лунки 96-луночного планшета с прозрачным дном, обработанным культурой тканей.

Для нереплицирующегося анализа используйте PBS, содержащий 0,02% тилоксапола, для двукратной промывки клеток. И используйте нереплицирующуюся среду для повторного суспендирования клеток. Используйте нереплицирующуюся среду для разбавления клеток до OD580 0,1 и добавьте нитрат натрия до конечной концентрации от 0,5 до 5 миллимоляров из свежеприготовленного одного молярного запаса.

Распределите 200 микролитров клеток с OD580 0,1 во все лунки 96-луночного планшета с чистым дном, обработанной культурой тканей. После подготовки тест-агентов в соответствии с текстовым протоколом добавьте два микролитра тест-агента один в ряды от A до E и два микролитра тест-агента два в ряды от E до H и тщательно перемешайте. Для повторения анализов инкубируйте микропланшеты M.smegmatis при 37 градусах Цельсия, 20% O2 и 5% CO2 в течение от одного до 48 часов.

В те моменты, когда CARA будет использоваться в качестве считывателя, используйте многоканальный пипетку p200 объемом от 50 до 75 микролитров для осторожного повторного суспендирования содержимого лунки пробирной пластины типа MIC90 путем пипетирования вверх и вниз от пяти до 10 раз. Затем с помощью наконечников пипеток аккуратно вращайте содержимое лунок круговыми движениями. Переложите 10 микролитров неразбавленного содержимого пробирной лунки в соответствующие лунки микропланшета CARA, избегая разбрызгивания во время переноса, следя за тем, чтобы 10 микролитров аликвоты попали в середину лунок микропланшета CARA.

С помощью пластичной ленты обвяжите стопки микропланшетов CARA, а затем поместите их в закрывающийся пластиковый пакет. Инкубируйте микропланшеты M.smegmatis CARA при температуре 37 градусов Цельсия с 20%O2 в течение одного-двух дней для реплицирующихся планшетов и в течение двух-трех дней для нереплицирующихся планшетов. Когда в отрицательных контрольных лунках видна пленка бактериального роста или более крупные макроскопические колонии, используйте один набор из 12 наконечников p200 с многоканальной пипеткой, чтобы распределить 40 микролитров стерильного PBS вдоль стенок лунок и позволить PBS распределиться по верхним слоям агар/бактериальных микроколоний.

Приготовьте проявляющий реагент CARA, смешав пять миллиграммов резазурина и 50 миллилитров 5%Tween80 в PBS. Добавьте 50 микролитров свежеприготовленного проявляющего реагента CARA в каждую лунку микропланшета CARA. Затем покачайте пластины вперед и назад несколько раз, чтобы помочь распределить реагент по агару и бактериальному мату в каждой лунке.

Поместите планшеты в закрывающийся пластиковый пакет и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия не менее 30 минут для выявления M.smegmatis. Перед считыванием показаний флуоресценции поместите микропланшеты CARA в биозащитный колпак на 15 минут при комнатной температуре со снятыми крышками. При использовании спектрофотометров BSL3 вне шкафа биобезопасности наклейте на пластину наклейку оптического качества PCR и плотно запечатайте ее мягким бумажным полотенцем, слегка надавливая на поверхность наклейки.

Определение флуоресценции с помощью верхнего считывания с возбуждением на 530 нанометрах и излучением на 590 нанометрах. Заболачивать тарелку не нужно. Чтобы проанализировать данные, построите график концентрации ингибитора по оси X в виде log10 и флуоресценции по оси Y в линейном масштабе.

Обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительной информации. Концентрация испытуемого агента, которая приводит к тому, что флуоресценция CARA не поднимается выше фоновых уровней, является CARA-MBC более чем равным 99, что показано здесь. Индекс «больше, чем 99» указывает на то, что CARA-MBC обеспечивает расчетную концентрацию тестируемого агента, которая приводит к уничтожению бактерий более чем равным двум log10.

Соединения подозреваются в оказании постантибиотического эффекта, если они демонстрируют статическое окно, определяемое как более чем четырехкратный сдвиг вправо между кривыми MIC и CARA. Статическое окно указывает на то, что молекула, активная против репликации M.tuberculosis, может быть бактериостатической, а не бактерицидной. Для молекул с мощным постантибиотическим эффектом статические окна могут быть трудными для наблюдения, и они становятся очевидными только после изучения расширенной оси Y для флуоресценции CARA, как показано здесь.

Здесь показаны реплицирующиеся и нереплицирующиеся активные молекулы, протестированные с помощью MIC90 и CARA. В то время как изониазид и линезолид, по-видимому, обладают активностью против нереплицирующихся бактерий по анализу MIC90, CARA предполагает, что они неактивны в тестируемых условиях. В этом эксперименте CARA воздействие на M.smegmatis возрастающих концентраций рифампицина показало воздействие всего за один час и показало увеличение бактерицидной активности в период от трех до 24 часов, убивая более чем в два-три log10 при примерно 10 микрограммах на миллилитр к 24 часам.

После освоения этот метод может быть выполнен примерно за два часа для подготовки планшетов, менее часа для переноса ячеек на планшеты CARA и примерно за один-два часа для развития и измерения флуоресценции пластин CARA, если это сделано правильно. При попытке использовать эту процедуру важно помнить об использовании CARA в качестве прогностического анализа, чтобы определить, обладает ли соединение бактерицидной или бактериостатической активностью против микобактерий, которые реплицируются или не реплицируются. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как настроить CARA и анализировать данные таким образом, чтобы помочь предсказать тип активности соединения.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.