LED Thermo Flow - Сочетание оптогенетика с проточной цитометрии

Общая цель этого метода заключается в стимуляции оптически контролируемых веществ во время проточных цитометрических измерений. Это новое устройство может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной сигнализации, сочетая мощность оптически контролируемых веществ с проточной цитометрией. Впервые оптогенетические инструменты могут быть охарактеризованы и проанализированы с помощью проточной цитометрии.

До настоящего времени не существовало сопоставимого устоявшегося метода. Для начала суспензируйте трансдуцированные лимфоциты Рамоса В в концентрации один миллион клеток на миллилитр и перенесите их в стеклянную пробирку FACS. Затем замените черное уплотнительное кольцо проточного цитометра на резиновое уплотнительное кольцо и нанесите силиконовую смазку для создания лучшего уплотнения.

Вставьте стеклянную трубку в проточный цитометр и разместите светодиодный прототип вокруг трубки с выключенным светом. Измерьте интенсивность флуоресценции Dronpa в канале GFP. Наиболее важным этапом процедуры является работа со стеклянными трубками.

Стеклянные трубки FACS очень хрупкие, поэтому перед проведением экспериментов рекомендуется попрактиковаться во введении стеклянных трубок в цитометр. Затем включите 500-нанометровый светодиодный свет на внешней стороне трубки и продолжайте измерять интенсивность флуоресценции Dronpa. Увеличивайте интенсивность светодиодных ламп до тех пор, пока интенсивность флуоресценции Dronpa не уменьшится, чтобы оценить минимальную необходимую интенсивность света для измерения фотопереключения белка Dronpa-Linker-Dronpa.

Затем включите 400-нанометровый светодиодный свет прототипа на внешней стороне трубки и продолжайте измерять интенсивность флуоресценции Dronpa. Увеличивайте интенсивность света 400-нанометровых светодиодных ламп до тех пор, пока интенсивность флуоресценции Dronpa не увеличится. Начните с следования инструкциям по проектированию и изготовлению в сопроводительном текстовом протоколе, чтобы изготовить внутренний и внешний слои фотопереключающего светодиодного устройства.

Вставьте светодиоды с длиной волны 400 и 500 нанометров в каналы устройства. Приклейте их на место и протяните проволокой в соответствии с указаниями. Эти конкретные длины волн будут использоваться для переключения гибридных белков Dronpa-Linker-Dronpa между их темным и светлым состояниями.

Затем соберите устройство и убедитесь, что оно водонепроницаемо, чтобы предотвратить утечку, прежде чем включать трансформатор. После сборки устройства соберите лимфоциты Ramos B и суспендируйте их в плотности от трех до десяти миллионов клеток на миллилитр. Перенесите 600 микролитров клеток в стеклянную пробирку FACS.

Поместите их на лед и защищайте клетки от света до тех пор, пока они не будут измерены. Подключите собранное устройство к водяному насосу с подогревом и отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию. Затем осторожно вставьте стеклянную трубку FACS в прибор и подключите ее к проточному цитометру.

Запишите интенсивность флуоресценции Dronpa в канале GFP. Конструкция этого оптогенетического устройства включает в себя камеру, которая может быть подключена к циркуляционному водопроводу для поддержания температуры образца на постоянном уровне. В то время как устройство излучало три разные длины волн, в образце FACS наблюдалось лишь незначительное увеличение температуры при прохождении через устройство воды с температурой 37 градусов Цельсия.

Слитая конструкция Дронпа-Линкер-Дронпа была клонирована и трансдуцирована в В-клетки Рамоса. При направлении в мономерное состояние 500-нанометрового источника света интенсивность излучения уменьшается. Затем, как только источник света переключается на свет 400 нанометров, мономер Dronpa быстро переходит в димерное состояние, и его интенсивность быстро увеличивается.

С помощью этого устройства цитозольный гибридный белок Dronpa-Linker-Dronpa удалось многократно переключать фото. Переход в темное состояние происходит медленно, в то время как переход в светлое состояние происходит практически мгновенно. Спонтанное восстановление флуоресценции Dronpa в темноте показывает, что эффективное переключение на яркую форму требует специфического освещения и происходит лишь медленно спонтанно.

Кинетический анализ показывает, что скорость фотопереключения в целом очень воспроизводима, и что даже после длительной инкубации в темноте только около десяти процентов флуоресценции восстанавливается без фотопереключения. После этой процедуры может быть выполнен любой проточный цитометрический анализ, включая измерения потока кальция, чтобы изучить функциональность выбранного вами оптогенетического инструмента. После своего развития этот метод проложит путь исследователям в области оптогенетики к изучению связей клеточных сигнальных путей.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как установить протокол фотокоммутации для вашего конкретного оптогенетического инструмента. Не забывайте, что ультрафиолетовое излучение может быть чрезвычайно опасным, и во время выполнения этой процедуры всегда следует надевать меры предосторожности, такие как защитные очки.