Визуализация IL-22-экспрессирующих Лимфоциты Использование Reporter Мыши

Общей целью этой процедуры генетической модификации мышей является идентификация, очистка и характеристика иммунных клеток, продуцирующих IL-22. Клетки иммунной системы выделяют медиаторы, называемые цитокинами, которые отвечают за защиту от чужеродных агентов, таких как бактерии, и восстановление поврежденных тканей. IL-22 является одним из таких цитокинов, и ему приписывают множество функций, начиная от восстановления тканей и заканчивая патологией.

Сообщается, что ряд различных типов клеток иммунной системы способен его производить. Поэтому, чтобы выяснить, какие клетки на самом деле производят IL-22, мы разработали новую мышь-репортера IL-22. Это позволило нам идентифицировать соответствующих продуцентов IL-22 in vivo у мышей в нормальных условиях и на модели воспалительного заболевания кишечника.

Мы также использовали репортерные ячейки для очистки экспрессоров IL-22 для определения других их свойств. Кратко изложен метод генерации репортерных мышей и описаны методы анализа. Описанные способы могут быть применены к другим генам с целью идентификации экспрессоров и очистки жизнеспособных экспрессирующих клеток для дальнейшей характеристики.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии о биологической активности IL-22 и свойствах клеток, которые его производят. Вместе со мной эту процедуру будут демонстрировать биолог Джули Хиксон, постдок Кэролайн Эндрюс и научный сотрудник лаборатории доктора Дарема Вэньцин Ли. После вставки репортерного гена tdTomato в челночной вектор, заменяя ген GFP в том же месте, используйте соответствующую бактериальную искусственную хромосому или шаблон BAC для амплификации гомологических боксов A и B до первого транслируемого экзона IL-22 в реакционной системе ПЦР объемом 50 микролитров.

Затем трансформируйте очищенные векторы в компетентные бактериальные клетки на агаровых пластинах Лурии-Бертани или LB, содержащих хлорамфеникол и ампициллин при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубации засейте две-три колонии в одном миллилитре бульона LB, дополненного левомицетином при температуре 37 градусов Цельсия и 225 оборотах в минуту. Через час нанесите по 100 микролитров каждой смеси на агаровую пластину LB с добавлением хлорамфеникола и сахарозы для ночного культивирования при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующее утро переложите большие колонии на новую пластину LB с хлорамфениколом, а маленькие колонии — на другую пластину с агаром LB и подвергните пластины воздействию ультрафиолетового света в течение 30 секунд. Затем выберите чувствительную к ультрафиолетовому излучению колонию и используйте гетерозиготный праймер tdTomato IL-22 для подтверждения наличия модифицированной ДНК BAC методом ПЦР. После удаления селезенки и тимуса используйте щипцы для рассечения с тонким наконечником, чтобы собрать жемчужно-белые брыжеечные лимфатические узлы, расположенные близко к стенке тонкой кишки.

Затем удалите всю тонкую кишку и толстую кишку и с помощью ножниц извлеките расширенные овальные пейеровские пятна вдоль кишечника. Когда все лимфатические ткани будут собраны, измельчите брыжеечные лимфатические узлы и участки Пейера между двумя матовыми предметными стеклами в PBS с добавлением FBS на льду. После получения отдельных суспензий одиночных клеток селезенки и тимуса таким же образом, центрифугирование клеток селезенки с последующим лизисом эритроцитов селезенки с использованием одного миллилитра лизирующих буферов ACK.

Через одну минуту восстановите изотоничность с помощью девяти миллилитров PBS и снова центрифугируйте клетки. Ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах PBS и отфильтруйте клетки через сетчатое фильтр 100 микрон. Затем соберите клетки еще одним центрифугированием, суспендируя гранулу в пяти миллилитрах среды RPI для подсчета методом исключения трипанового синего.

После забора тонкой кишки от двенадцатиперстной кишки до подвздошной кишки вместе со всей толстой кишкой используйте щипцы для удаления лишней жировой и брыжеечной ткани из кишечника и немедленно поместите ткань кишечника в ледяную PBS. Используйте щипцы для забора пейеровых пятен вдоль дистальной области тонкой кишки. Затем с помощью ножниц вскройте кишечник вдоль и тщательно промойте ткани 10 миллилитрами ледяного PBS.

Перенесите образец в 20 миллилитров буфера для предварительного переваривания в течение двух 30-минутных инкубаций при 37 градусах Цельсия и 50 об/мин в шейкере, обхватывая ткань в течение 30 секунд при 12 000 об/мин и продавливая все фрагменты через клеточный фильтр толщиной 100 микрон в конце каждой инкубации для сбора эпителиального клеточного слоя. Затем добавьте 20 миллилитров свежего раствора ЭДТА в клеточную кашицу для еще одной 30-минутной инкубации с встряхиванием при температуре 37 градусов Цельсия, фильтруя и охлаждая эпителиальные клетки кишечника в конце инкубации, как только что продемонстрировано. Поместите оставшиеся фрагменты кишечника на лед и соберите объединенные эпителиальные клетки кишечника путем центрифугирования с последующим промыванием в 10 миллилитрах HBSS с добавлением FBS.

Повторно суспендируйте промытую гранулу в восьми миллилитрах 44% коллоидного кремнезема и покройте клеточную суспензию пятью миллилитрами 67% коллоидного кремнезема. Разделите клетки центрифугированием и с помощью пипетки объемом в один миллилитр удалите верхние пять миллилитров среды для разделения клеток. Затем соберите клетки на границе раздела и промойте эпителиальные клетки кишечника в 10 миллилитрах среды RPMI, повторно взвесив гранулу в пяти миллилитрах свежей RPMI.

После приготовления суспензий одиночных клеток селезенки от мышей IL-22 td-Tomato, как только что было продемонстрировано. Ресуспендируйте клетки в соотношении от 10 до 7 клеток на миллилитр в стерильных PBS и используйте метод выделения CD4-отрицательных клеток мыши для очистки CD4-положительных Т-клеток. Затем пометьте Т-клетки анти-CD4 и анти-CD45RB антителами в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.

По окончании инкубации соберите клетки центрифугированием с последующей промывкой в двух миллилитрах PBS с добавлением FBS. Ресуспендируйте промытую гранулу в одном миллилитре свежих PBS и FBS и отсортируйте меченые Т-клетки с помощью проточной цитометрии по их коэкспрессии CD4 и CD45RB. Когда все клетки будут отсортированы, соберите их центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в концентрации от 10 до 6 клеток на миллилитр в стерильном PBS для введения клеток мышам-реципиентам с нокаутом RAG1

Для создания мышиного репортера IL-22 была использована рекомбинация трансгенов для модификации бактериальной искусственной хромосомы, несущей саранчу IL-22, которая также содержит маркер положительного отбора и ген устойчивости к антибиотикам хлорамфениколу. После введения tdTomato в экзон 1 последовательность сигнальных пептидов была нарушена, что привело к тому, что репортер tdTomato оказался в ловушке внутри клеток, экспрессирующих IL-22, и что стало возможным их обнаружение и выделение с помощью проточной цитометрии. Чтобы проверить достоверность данных репортеров IL-22, сгенерированные in vitro спленоциты могут быть культивированы в Th22 или нейтральных условиях с экспрессией IL-22 tdTomato, очевидной как с помощью проточной цитометрии, так и с помощью флуоресцентной микроскопии.

Репортеры IL-22 in vivo обнаружили его в различных тканях мышей в гомеостатических условиях, при этом большая часть сигнала наблюдалась в собственных клетках пластинки кишечника, но не в подмышечных лимфатических узлах, селезенке или тимусе. В модели колита у мышей, вызванного переносом репортерных CD4-положительных CD45RB высоких Т-клеток нокаута RAG1, репортеры tdTomato сначала визуализируются в брыжеечных лимфатических узлах, но их последующее накопление происходит в собственной пластинке дистального отдела тонкой кишки и тканей толстой кишки. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о выборе правильного клона BAC.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как создание моделей легочной или кожной инфекции с использованием этой мыши-репортера, чтобы ответить на дополнительные вопросы о роли IL-22 в защите хозяина и восстановлении тканей. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области иммунологии к изучению функции секретируемых белков, которые демонстрируют низкую экспрессию, используя мышиную модель, подобную этой. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создать трансгенную репортерную мышь и идентифицировать репортерные гены IL-22 in vitro и in vivo.