Мышь Изолированные перфузировались почки Техника

Общая цель этого протокола заключается в анализе изолированной функции почек в перфузированной почке мыши ex vivo. Без учета влияния артериального давления, гормонов или вегетативной нервной системы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нефрологии.

Вводит внутренности в изолированную функцию органа и служит элегантным инструментом для изучения острого повреждения почек. Главное преимущество ИПК заключается в том, что функция органа изучается при отсутствии системных воздействий. После подготовки мыши к операции с помощью ножниц проведите срединную лапаротомию от лобкового гребня до грудины.

Сначала раскройте кожу, а затем мышцы живота. Далее извлеките кишечник и поместите его с левой стороны мыши, сбоку от живота. Теперь освободите мочевой пузырь от соединительной ткани и обнажите как мочеточники, так и мочеиспускательный канал.

Для этих процедур располагают все лигатуры с помощью швов 5-0. Первая лигатура устанавливается вокруг левого мочеточника. Плотно закройте его двойным хирургическим узлом.

Далее по той же методике наложите лигатуру вокруг мочеиспускательного канала. Затем наложите лигатуру на лассо вокруг всего мочевого пузыря, но оставьте его развязанным. После наложения первых трех швов с помощью глазных ножниц сделайте разрез в мочевом пузыре длиной в один миллиметр.

В этот разрез поместите канюлю, изготовленную из двух сантиметров трубки ПЭ-50. Теперь закройте лигатурой, которая заарканивает мочевой пузырь, закрепив канюлю. После канюлирования мочевого пузыря теперь разрежьте левый мочеточник и уретру дистальнее лигатур.

Теперь мочевой пузырь должен быть прикреплен только к правому мочеточнику и должен свободно двигаться. Далее удалите соединительные ткани и жир, окружающие брюшную аорту. Затем поместите лигатуры вокруг середины обнаженной аорты и чуть ниже диафрагмы между верхней брыжеечной артерией и чревным стволом.

Держите каждый из них свободным. Далее наложите лигатуру вокруг верхней брыжеечной артерии. Теперь поместите третью лигатуру вокруг аорты непосредственно под правой почечной артерией и над левой почечной артерией.

Это лигатура под номером семь. Наконец, наложите лигатуру вокруг пакета с каудальной веной. Теперь поместите зажим между лигатурой номер семь и разветвлением левой почечной артерии.

Затем сделайте небольшой разрез в области аорты, каудально до лигатуры семь, стараясь не перерезать дорсальную стенку и растянуть отверстие с помощью расширителя сосуда. В отверстие вставьте двухсантиметровую вытянутую канюлю ПЭ-50, протолкнув наконечник как раз в зажим. Затем откройте зажим.

Далее надавливайте на кончик иглы краниально до тех пор, пока он не достигнет места соединения правой почечной артерии и аорты. Теперь закройте лигатурой семь, а затем закройте лигатуру в средней точке брюшной аорты. Продолжайте, открывая грудную клетку ножницами, рассекая диафрагму.

Затем одним разрезом отделите аорту, полую вену, сердце и вегетативные нервы. Теперь запустите регулирование давления перфузионного насоса и поддерживайте среднее давление в диапазоне от 80 до 100 миллиметров ртутного столба. Теперь закройте три оставшиеся неперевязанные лигатуры вокруг аорты и пакета каудальной вены.

С помощью ножниц освободите правую почку от окружающей соединительной ткани и освободите ее от жировой капсулы. Разрежьте аорту проксимально к лигатуре между верхней брыжеечной артерией и чревным стволом. Затем перережьте верхнюю брыжеечную артерию дистально к лигатуре вокруг верхней брыжеечной артерии.

Теперь удалите пучок поддерживающих почку сосудов, стараясь не разрезать сами сосуды. Затем разрежьте печень в месте соединения с почкой, но оставьте небольшую часть печени прикрепленной к ней, чтобы полая вена оставалась открытой за счет нее. Следующим этапом является удаление пучка почек у мыши.

Теперь оставьте почку в камере и удалите мышь. На месте соединения между печенью и почкой поместите лигатуру аркана. Затем канюльизируйте полую вену венозной катетерью и закройте лигатуру аркана.

Теперь почка должна стабильно сидеть в коробке. Венозный отток по венозной линии должен начаться незамедлительно. Отток мочи начнется примерно через три минуты.

Перистальтика мочеточника должна начаться немедленно и оставаться стабильной в течение как минимум одного часа. Закройте коробку. Теперь подготовка завершена и должна оставаться жизнеспособной в течение как минимум часа.

После использования описанного метода на мышах C57 black 6 была проверена тканевая жизнеспособность четырех почек после часа непрерывной перфузии. Давление поддерживалось на непрерывном уровне 100 миллиметров ртутного столба. Кровоток перфузата и сосудистое сопротивление оставались стабильными во всех четырех почках.

Скорость клубочковой фильтрации оценивали с помощью клиренса инулина FITC, который должен увеличиваться с течением времени, но не значительно. Фракционную экскрецию натрия и калия оценивали через 55 минут перфузии. Эти параметры увеличились по сравнению с ситуацией in vivo.

Через 55 минут моляльность мочеприемника не поднималась выше осмоляльности венозного оттока. Затем почки фиксировали и оценивали их ультраструктуру с помощью ПЭМ. Клубочки в сегментах S1 проксимальных канальцев оказались в значительной степени неизмененными.

Некоторые, но не все сегменты S2, S3 проксимальных канальцев в толстых восходящих конечностях, которые не находились близко к сосудистым пучкам, имели признаки повреждения органов. При ближайшем рассмотрении дистальные извитые канальцы и собирательные протоки не показали признаков некроза. В целом, почки отражали то, что сообщалось о перфузированных почках крыс.

После этой процедуры на ткани могут быть выполнены такие методы анализа, как визуализация или анализ фактов с последующим анализом белка или РНК для получения дополнительной информации.