С помощью РНК-последовательности для обнаружения Novel сращивание Варианты, относящиеся к лекарственной устойчивости In Vitro Модели рака

Общая цель данного протокола заключается в исследовании связи аберрантного сплайсинга с профилями лекарственной устойчивости в моделях in vitro солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области молекулярной фармакологии и устойчивости к химиотерапии, например, каковы механизмы, лежащие в основе лекарственной устойчивости на посттранскрипционном уровне? Основное преимущество этого метода заключается в том, что он сочетает в себе хорошо зарекомендовавший себя протокол скрининга цитотоксичности с мощным транскриптомным анализом нового поколения, основанным на секвенировании.

Этот метод может привести к лучшему пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе неэффективности химиотерапии, и улучшит раннее выявление лекарственной устойчивости. Этот метод может дать представление об общегеномных детерминантах лекарственной устойчивости в моделях клеточных линий. Но он также может быть применен к другим системам, таким как первичные образцы пациента и ксенотрансплантат.

Демонстрировать эту процедуру будет Йохан Фомирно, техник из нашей лаборатории в Онкологическом центре Амстердама. Для проведения МТТ-анализа на лейкозные клетки готовят 96-луночный экспериментальный планшет с плоским дном. Выделите лунки для концентраций лекарств для контроля клеток и для контроля среды без клеток.

Приготовьте препарат для разведения диапазона дексаметазона или декса. Добавьте 30 микролитров из каждого разведения dex в соответствующую лунку 96-луночного планшета. Убедитесь, что каждая концентрация указана в трех экземплярах.

Собирайте экспоненциально растущие лейкозные клетки и повторно суспендируйте их при оптимальной концентрации при посеве. Добавьте 120 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку, содержащую либо раствор препарата, либо питательную среду, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 72 часов. После этапа инкубации добавьте по 15 микролитров реагента МТТ в каждую лунку с помощью повторяющейся пипетки.

Встряхивайте тарелку в течение пяти минут с помощью шейкера для тарелок максимум до 900 встряхиваний в минуту. Поместите планшеты обратно при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в инкубатор для клеточных культур и инкубируйте еще четыре-шесть часов. После инкубации обязательно полностью восстановите кристаллы формазана, так как значения абсорбции зависят от правильной солюбилизации соединения.

Добавьте 150 микролитров подкисленного изопропанола в каждую лунку и хорошо перемешайте многоканальной пипеткой, чтобы полностью повторно суспендировать все кристаллы формазана. С помощью считывателя микропланшетов определить оптическую плотность или OD на 540 и 720 нанометрах для обеспечения точного измерения с поправкой на фон OD.To выполнить анализ SRB на клетки карциномы поджелудочной железы, подготовить 96-луночный экспериментальный планшет с плоским дном. Семена клеток карциномы поджелудочной железы растут в экспоненциальной фазе в трех размерах в 96-луночных плоских донных пластинах с соответствующей плотностью в 100 мк среды с помощью многоканальной пипетки.

Добавьте 100 микролитров лунок среднего и среднего качества и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом, чтобы обеспечить надлежащую адгезию клеток к пластине. Добавьте 100 микролитров из каждого разведения в соответствующую лунку 96-луночного планшета с помощью многоканальной пипетки. Убедитесь, что каждая концентрация расположена в трех экземплярах.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 72 часов. Далее добавьте в лунки 25 микролитров холодного раствора ТСА с помощью многоканальной пипетки. Инкубируйте планшеты не менее 60 минут при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы выпасть в осадок и зафиксировать белки на дне лунок.

Опорожните тарелку, удалив среду, и кратковременно высушите на салфетке. Промойте пять раз водой из-под крана перед опорожнением тарелки и сушкой при комнатной температуре. Добавьте 50 микролитров раствора SRB в лунку с помощью повторяющейся пипетки и окрашивайте в течение 15 минут при комнатной температуре.

Затем опорожните тарелку, удалив пятно SRB. После четырехкратного мытья тарелки 1%-ной уксусной кислотой опорожните тарелку и дайте ей высохнуть при комнатной температуре. Добавьте 150 микролитров раствора Tris на лунку с помощью многоканальной пипетки и перемешайте в течение трех минут на планшетном шейкере максимум до 900 встряхиваний в минуту.

Считайте оптическую плотность на 540 нанометрах. Уменьшите количество образцов в 300 раз g в течение трех минут. После удаления надосадочной жидкости извлеките общую мРНК с помощью коммерчески доступных спиновых колонок с диоксидом кремнезема.

Определяют концентрацию и чистоту общей РНК с помощью УФ-ВИД спектрофотометра. Чтобы подготовить библиотеку секвенирования, используйте два микрограмма общей мРНК на образец. Следуйте протоколу подготовки библиотеки мРНК в соответствии с инструкциями производителя.

После объединения библиотек в одном образце до конечной концентрации 10 наномолей на литр с помощью биоанализатора используйте высокопроизводительную систему секвенирования с режимом одиночного чтения 100 пар оснований. Разработайте все праймеры так, как описано в текстовом протоколе. Для синтеза кДНК первой цепи настроили обратную транскрипцию одного микрограмма выделенной РНК в кДНК с использованием 200 единиц на микролитр обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони в ее реакционном буфере, разбавленном от одного до пяти стерильной водой.

Чтобы провести реакцию ОТ-ПЦР, добавьте один микролитр кДНК в реакционную смесь для ПЦР и поместите пробирки в термоциклер. Запустите программу так, как описано в текстовом протоколе. После ПЦР загрузите образцы в 1%-ный агарозный гель и запустите гель в буфере TBE при напряжении 100 вольт в течение примерно 30 минут в системе электрофореза.

Чтобы избежать перекрестного загрязнения, используйте фильтрующие наконечники при выполнении анализа qRT-PCR. Для проведения количественной ОТ-ПЦР необходимо приготовить реакционную смесь цианинового зеленого ПЦР для каждого конкретного варианта сплайсинга, который должен быть обнаружен, а также для гена домашнего хозяйства. Загрузите мастер-микс на белую 96-луночную пластину и подготовьте дубликаты для каждого образца.

Добавьте пять микролитров кДНК, разведенных в 10 раз в воде, в каждую смесь перед помещением пластины в термоамплификатор. Здесь изображены кривые ингибирования роста, определенные с помощью анализа MTT для лейкозных клеток и анализа SRB для клеток карциномы поджелудочной железы. Кривые для резистентных к дексаметазону и гемцитабину клеток смещены вправо, что указывает на ингибирование роста по сравнению с родительскими чувствительными клетками.

Концентрацию и качество библиотек кДНК для всех клеточных линий определяют с помощью ДНК-чипа биоанализатора. Электроферограммы показывают пики флуоресценции примерно на 300 парах оснований, что свидетельствует о хорошем качестве для последующей процедуры секвенирования РНК. Короткие чтения кандидата в гены DDX5 могут быть визуализированы в виде графиков Сашими, где соединительные линии представляют собой сплайс-соединения.

Транскрипт DDX5 демонстрирует дифференцированное использование экзона 12 и клеток дикого типа CEM и CEM/R30dm по сравнению с устойчивыми к глюкокортикоидам клеточными линиями, CEM-C3 и CEM-R5. Результаты секвенирования РНК проверяются путем проведения ОТ-ПЦР на выбранных генах, праймерные пары и уступают экзонам, расположенным выше и ниже по течению от альтернативно сплайсированного экзона. Здесь показан дифференциальный сплайсинг гена DDX5.

Количественное определение дифференциально сплайсированных транскриптов с помощью анализа qRT-PCR с использованием изоформ-специфичных обратных праймеров подтверждает специфическую подавительную регуляцию варианта сплайсинга DDX5 дельта-экзона 12 и специфических подлиний, устойчивых к глюкокортикоидам. После освоения этой техники ее можно сделать за три-четыре недели. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что образцы РНК должны находиться на льду, чтобы избежать деградации.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как эктопическая сверхэкспрессия нового варианта сплайсинга. Это позволит ответить на дополнительные вопросы, такие как функциональное влияние альтернативного профиля сплайсинга на лекарственную устойчивость. Этот метод может проложить путь для исследований в области молекулярной фармакологии для изучения полногеномных детерминант лекарственной устойчивости.