Альтернативный подход к Подготовка проб с низкой Количество сотовых для анализа ПЭМ

Общая цель этой процедуры заключается в подготовке образцов с малым числом клеток для проведения ПЭМ-анализа эффективным и воспроизводимым способом. Этот метод может помочь выявить все структуры реальных клеток и улучшить физиологические условия в биомедицинской сфере. Основное преимущество этой методики заключается в том, что при малом числе клеток можно получить как качественные, так и количественные результаты воспроизводимым способом.

Для начала используйте факты, чтобы отсортировать 10 000 гемопоэтических стволовых клеток, или ГСК, в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Содержит 600 микролитров модифицированной среды дульбекко isocoves с 10% FBS. Используя центрифугу с откидными ведрами, отсортированные HSC вращайте в 1000 раз больше G в течение 10 минут.

Используйте нееврейскую аспирацию, чтобы удалить все, кроме 200 микролитров среды. Для фиксации клеток добавляют 0,2 мл свежеприготовленного Х фиксирующего раствора, и выдерживают при комнатной температуре в течение одного часа. Далее добавьте 600 микролитров 0,1 молярного какодилатного буфера для промывания клеток.

Снова центрифугируйте ячейки, на этот раз при температуре 30 градусов Цельсия. Затем, после центрифугирования и удаления всего буфера, кроме 200 микролитров, добавьте 200 микролитров двух миллиграммов на миллилитр синего Эванса в буфере для какодилатов и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы окрашивать клетки. Используйте 600 микролитров 0,1 молярного какодилатного буфера для трехкратного промывания клеток.

Затем повторно суспендируйте клетки в оставшихся 200 микролитрах буфера перед тем, как перенести клеточную суспензию в пробирку объемом 0,5 мл. На этом этапе гранула должна быть видна в трубке. С помощью настольной центрифуги вращайте ячейки со скоростью 1000 G в течение 10 минут.

Затем аккуратно удалите буфер, не потревожив теперь видимую крошечную клеточную гранулу, оставив 50 микролитров буфера в пробирке. Приготовьте 4%-ный раствор агарозы, добавив 200 мг низкоплавкой агарозы к пяти миллилитрам 0,1 молярного какодилатного буфера в 15 мл пробирки. Растопите агарозу, переложив пробирку в кипящую воду в стеклянной бутылке объемом 100 мл.

Добавьте 200 микролитров раствора агарозы в пробирку клеточной суспензии. Немедленно центрифугируйте при температуре 1 000 раз G и 30 градусах Цельсия в течение 10 минут. Убедившись, что ячейки помещены в полутвердую агарозу на дно пробирки, немедленно перенесите пробирку на четыре градуса Цельсия, или лед, на 20 минут, чтобы агароза затвердела.

С помощью иглы 27 калибра осторожно перенесите затвердевшую агарозу, содержащую клеточную гранулу, в пластиковую чашку Петри объемом 35 мл, содержащую 0,1 молярного какодилатного буфера. С помощью скальпеля разрежьте затвердевшую агарозу, содержащую клеточную гранулу, на один кусок размером примерно один-два миллиметра. Затем переложите его в новую пробирку объемом 1,5 мл.

Добавьте 600 микролитров 0,1 молярного какодилатного буфера и промойте гранулу агарозных клеток, добавляя и удаляя буфер с помощью пипетки. Снимите буфер с гранулы агарозных клеток и в вытяжной шкаф, надев защитную одежду и перчатки, добавьте один миллилитр 1%-ного раствора тетраоксида осмия. Инкубируйте клеточную гранулу при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа.

После инкубации промойте образец три раза. Переложите его в стеклянный сцинтилляционный флакон объемом 20 мл с крышкой. Затем обезвоживайте образец с помощью серии этанола.

Затем инфильтрируйте образец в возрастающих концентрациях смолы LX 112 в этаноле перед инкубацией в 100% смоле два раза в течение 60 минут каждый раз. С помощью щипцов осторожно перенесите образец на дно резиновой формы в форме пирамидального наконечника и добавьте чистую смолу поверх образца, чтобы заполнить форму. Инкубируйте образец при температуре 60 градусов Цельсия в течение 72 часов, чтобы полимеризовать смолу.

Когда смола полимеризуется, извлеките ее из форм, скрутив резиновую форму. В пирамиде из полимеризованной смолы должно быть видно небольшое черное скопление клеток. Используйте цианоакрилат для крепления пирамиды из полимеризованной смолы к монтажному цилиндру для разрезания.

После монтажа блока на ультрамикротом с помощью бритвенного лезвия и алмазного ножа обрежьте блок-пирамиду, сделав короткую, широкую трапециевидную форму с верхом и низом блока, параллельными друг другу, и с равномерно наклоненными сторонами. Затем с помощью алмазного ножа обрежьте блок вокруг элемента гранулы и удалите пластиковые участки вокруг элемента гранулы с агарозным кусочком. С помощью ультрамикротома вырежьте срезы размером в один микрометр и с помощью инструмента для ресниц и металлической петли переместите срезы из водной лодки на стеклянную горку.

Затем поместите предметные стекла на горячую плиту при температуре 37 градусов Цельсия для высыхания. С помощью шприца с фильтром 0,22 микрометра добавьте каплю раствора телуатинового синего в срезы и инкубируйте в течение трех минут. Затем с помощью дистиллированной воды поднимите горки и дайте срезам высохнуть.

После высыхания проверьте срезы под световым микроскопом, чтобы определить положение клеток. Затем с помощью алмазного ножа вырежьте ультратонкие участки. Затем с помощью инструмента для ресниц переместите две-три секции на сетку 200 сетки от водной лодки и поместите в стеклянную чашку Петри.

Переложите блюдо с решетками на горячую плиту при температуре 30 градусов Цельсия на 30 минут, чтобы секции подсохли. Добавьте капли 1%-ного уранилацетата, и выдерживайте при комнатной температуре 10 минут, чтобы окрасить сетки. Затем используйте дистиллированную воду для полоскания от шести до восьми раз.

Окрашивайте цитратом свинца Рейнольдса при комнатной температуре в течение пяти минут, а затем смойте от шести до восьми раз. Переложите стеклянную чашку Петри с решетками на горячую плиту при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы высушить секции. Наконец, проанализируйте срезы с помощью электронного микроскопа при напряжении 87 киловольт.

Здесь при малом увеличении показаны полутонкие окрашенные толуидином в синий цвет срезы блоков, содержащих крошечную клеточную гранулу, которые подтверждают скопление клеток. Это изображение с большим увеличением показывает неповрежденную морфологию клеток. На этом рисунке представлено поле обзора клеточного кластера из ультратонких срезов, которые были окрашены уранилацетатом и цитратом свинца и проанализированы с помощью электронной микроскопии.

Здесь показан один ГСК, демонстрирующий, что морфология и ультраструктура клеток хорошо сохранились. На высокодетализированной электронной микрофотографии отдельного ГСК с большим увеличением видны внутриклеточные ультраструктуры. Кроме того, изображения с большим увеличением запечатлели хорошо сохранившуюся структуру и целостность субклеточных органелл, таких как митохондрии.

После освоения эта техника может быть выполнена за пять-шесть часов, а для продвинутого окрашивания синим цветом и внедрения агарозы, и тогда обычная обработка ПЭМ займет пять-шесть дней, если она выполнена правильно. Таким образом, после просмотра этого видео у вас есть хорошее понимание того, как подготовить образцы из реальных клеток для анализа ПЭМ.