Альтернативный подход к Подготовка проб с низкой Количество сотовых для анализа ПЭМ

Общая цель данной процедуры заключается в подготовке образцов с небольшим количеством клеток для проведения анализа методом ПЭМ эффективным и воспроизводимым способом. Этот метод позволяет выявить все структуры реальных клеток и обеспечить более точные физиологические условия в биомедицинской области. Основным преимуществом данной методики является возможность получения как качественных, так и количественных результатов при малом количестве клеток с высокой степенью воспроизводимости.

Для начала с помощью FACS отсортируйте 10 000 гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL, содержащую 600 µL модифицированной среды Dulbecco в Isocoves с 10% FBS. Используя центрифугу с поворотными стаканами, осадите отсортированные ГСК, центрифугируя при 1 000 ×g в течение 10 минут.

Осторожно аспирируйте среду, оставив 200 µL. Для фиксации клеток добавьте 0,2 mL свежеприготовленного двухкратного (2X) раствора фиксатора и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. Затем добавьте 600 µL 0,1 М какодилатного буфера для промывки клеток.

Снова центрифугируйте клетки, на этот раз при 30 °C. Затем после центрифугирования удалите весь буфер, кроме 200 µL, и добавьте 200 µL раствора еванс-блю в какодилатном буфере с концентрацией 2 mg/mL; инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут для окрашивания клеток. Промойте клетки трижды, используя по 600 µL 0,1 M какодилатного буфера.

Затем ресуспендируйте клетки в оставшихся 200 µL буфера, после чего перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 0,5 мл. На этом этапе в пробирке должен быть виден осадок. С помощью настольной центрифуги центрифугируйте клетки при 1 000 ×g в течение 10 минут.

Затем осторожно удалите буфер, не затрагивая ставший теперь видимым крошечный осадок клеток, оставив в пробирке 50 µL буфера. Приготовьте 4% раствор агарозы, добавив 200 mg низкоплавящей агарозы в пять мл 0.1 M какодилатного буфера в пробирке объемом 15 mL. Расплавьте агарозу, перенеся пробирку в кипящую воду в стеклянной бутыли объемом 100 mL.

Добавьте 200 µL раствора агарозы в пробирку с суспензией клеток. Немедленно центрифугируйте при 1 000 ×g и 30 °C в течение 10 минут. Убедившись, что клетки образовали осадок в полужидкой агарозе на дне пробирки, немедленно перенесите пробирку при температуре 4 °C или на лед на 20 минут для затвердевания агарозы.

С помощью иглы 27G осторожно перенесите застывший агароз, содержащий осадок клеток, в пластичную чашку Петри объемом 35 мл с 0,1 молярным какодилатом буфером. С помощью скальпеля обрежьте застывший агароз с осадком клеток, чтобы получился один фрагмент размером примерно один-два миллиметра. Затем перенесите его в новую пробирку объемом 1,5 мл.

Добавьте 600 µL 0,1 М какодилатного буфера и промойте агарозный осадок клеток, добавляя и удаляя буфер с помощью пипетки. Удалите буфер из агарозного осадка клеток и, работая в вытяжном шкафу в защитной одежде и перчатках, добавьте 1 mL 1% раствора тетраоксида осмия. Инкубируйте осадок клеток при температуре 4 °C в течение одного часа.

После инкубации промойте образец трижды. Перенесите его в стеклянную scintillation-кювету объемом 20 mL с крышкой. Затем обезводьте образец, используя серию разведений этанола.

Затем проведите инфильтрацию образца в растворах смолы LX 112 в этаноле с возрастающей концентрацией, после чего дважды инкубируйте образец в 100%-ной смоле по 60 минут. С помощью пинцета аккуратно перенесите образец на дно резиновой формы в виде пирамидального наконечника и залейте образец чистой смолой до заполнения формы. Инкубируйте образец при 60 °C в течение 72 часов для полимеризации смолы.

После полимеризации смолы извлеките ее из форм, повернув резиновую форму. В полимеризованной пирамиде из смолы должен быть виден небольшой черный кластер клеток. Используйте цианоакрилат, чтобы закрепить пирамиду из полимеризованной смолы на монтажном цилиндре для последующего срезания.

После установки блока в ультрамикротом используйте лезвие бритвы и алмазный нож, чтобы обрезать пирамидальный блок, придав ему форму короткой и широкой трапеции, при которой верхняя и нижняя части блока параллельны друг другу, а боковые стороны имеют равный угол наклона. Затем с помощью алмазного ножа обрежьте блок вокруг осадка клеток и удалите пластиковые секции вокруг фрагмента агарозы с осадком клеток. С помощью ультрамикротома сделайте срезы толщиной 1 µm, а затем с помощью инструмента-ресницы и металлической петли перенесите срезы из ванночки с водой на предметное стекло.

Затем поместите стекла на нагревательную площадку при 37 °C для высушивания. С помощью шприца с фильтром 0,22 мкм добавьте каплю раствора толуидинового синего на срезы и инкубируйте в течение трех минут. Затем промойте стекла дистиллированной водой и дайте срезам высохнуть.

После высушивания проверьте срезы под световым микроскопом, чтобы определить положение клеток. Затем с помощью алмазного ножа сделайте ультратонкие срезы. После этого, используя инструмент-ресничку, перенесите два или три среза из лодочки с водой на сетки с размером ячейки 200 mesh и поместите их в стеклянную чашку Петри.

Перенесите чашку с сетками на нагревательную платформу при температуре 30 °C на 30 минут для высушивания срезов. Добавьте капли 1% уранила ацетата и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут для окрашивания сеток. Затем промойте дистиллированной водой шесть-восемь раз.

Прокрашивайте цитратом свинца по методу Рейнольдса при комнатной температуре в течение пяти минут, после чего промойте шесть-восемь раз. Перенесите стеклянную чашку Петри с сетками на нагревательную плитку при 37 °C для высушивания срезов. В завершение проанализируйте срезы с помощью электронного микроскопа при 87 kV.

На данном изображении при малом увеличении представлены полутонкие срезы из блоков, содержащих крошечный осадок клеток, окрашенные толуидиновым синим, которые подтверждают наличие клеточного кластера. На этом изображении при большем увеличении видна сохранная морфология клеток. Данный рисунок представляет собой обзорное поле клеточного кластера на ультратонких срезах, окрашенных ацетатом уранила и цитратом свинца и проанализированных с помощью электронной микроскопии.

Здесь представлена одна ГСК, демонстрирующая, что морфология и ультраструктура клеток были хорошо сохранены. На электронном микрофотоснимке отдельной ГСК при большем увеличении детально видны внутриклеточные ультраструктуры. Кроме того, снимки с высоким увеличением зафиксировали хорошо сохраненную структуру и целостность субклеточных органелл, таких как митохондрии.

После освоения эта методика может быть выполнена за пять-шесть часов; при этом окрашивание синим красителем, заливка в агарозу и последующая стандартная подготовка для ПЭМ займут от пяти до шести дней при условии правильного выполнения. Таким образом, после просмотра этого видео вы получите хорошее представление о том, как подготавливать образцы из реальных клеточных препаратов для ПЭМ-анализа.