Метод прямых Сегментные Intra-печеночной доставка с помощью модели печени крысы Hilar зажима

Общая цель этой уникальной модели прикорневого зажима печени крысы заключается в том, чтобы обеспечить изучение влияния фармакологических молекул, представляющих интерес, на улучшение ишемического реперфузионного повреждения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области трансплантации печени о том, какие молекулы могут быть непосредственно введены в печень, чтобы помочь опосредовать ишемическое реперфузионное повреждение. Основное преимущество этой методики заключается в том, что исследуемая молекула вводится непосредственно в воротную вену, уменьшая объем распределения.

Применение этого метода распространяется на трансплантацию всех органов, поскольку он позволяет тестировать молекулы, которые могут быть добавлены к перфузатам органов для уменьшения повреждения ишемической реперфузии. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение из-за небольшого размера ветви воротной вены, используемой для канюляции. Начните с подтверждения соответствующего уровня седативного эффекта путем ущипывания пальцев ног, затем положите крысу на грелку под препарирующий микроскоп и ограничьте конечности.

Далее сделайте разрез кожи живота по средней линии от лобка до мечевидной кости с последующим аналогичным разрезом в брюшине по белой линии. Войдите в брюшную полость, стараясь не повредить мочевой пузырь или кишечник, и освободите печень от брюшины спереди рядом с мечевидным отростком. Сделайте поперечный разрез через кожу и брюшину на нижней границе правой доли печени и используйте изогнутый комариный зажим для втягивания мечевидного отростка.

Используйте реберные ретракторы, чтобы открыть ребра как можно дальше от средней линии, и разрежьте серповидные, диафрагмальные и желудочные связки. Затем с помощью смоченных стерильных ватных тампонов переверните печень вверх и разрежьте дополнительные связки по мере необходимости, чтобы получить доступ к портам. Используя марлю, смоченную солевым раствором, висцерально вращайте печень, затем удалите рыхлую соединительную ткань, расположенную над воротным отверстием, и рыхлую соединительную ткань, покрывающую длину воротной вены.

С помощью щипцов протолкните рыхлую соединительную ткань позади левой воротной вены, артерии и желчного протока, чтобы сделать окно, и неплотно обхватите сосуды швом 4-0 Поттса. Затем очистите рыхлую соединительную ткань, покрывающую заднюю ветвь до воротной вены у правой почки. Затем с помощью инсулинового шприца наберите 0,5 миллилитра крови из нижней полой вены и перелейте кровь в небольшой флакон

Центрифугируйте образец и соберите сыворотку в новый флакон для мгновенной заморозки в жидком азоте. Отрежьте два куска шва 7-0. Поместите первую петлю 7-0 вокруг левой воротной вены как можно дальше медиально и используйте изогнутый противомоскитный зажим, чтобы втянуть вену.

Поместите свободно завязанную вторую петлю 7-0 на заднюю ветвь к воротной вене рядом с ее пересечением с воротной веной. Теперь загрузите инфузионный насос пятимиллилитровым шприцем, содержащим три миллилитра реагента в 0,9% физиологическом растворе, и загрунтуйте трубку. Используйте микрохирургический зажим для захвата дистального отдела воротной вены, чтобы уменьшить кровотечение во время канюляции, и с помощью небольших микрохирургических ножниц прорежьте отверстие размером 0,5 миллиметра в вене между швом 7-0 и его пересечением с воротной веной.

С помощью катетера 27-0 канюлировать левую портальную венозную систему, вводя катетер через бифуркацию левой и правой воротных вен. Влейте один миллилитр нормального физиологического раствора, чтобы подтвердить положение канюли, и следите за тем, чтобы левая боковая и срединная доли печени побледнели. Вручную оцените, что катетер находится за пределами отверстия правой воротной вены, но не за пределами отрыва воротной вены, питающей срединную долю, затем зажмите шов Поттса, закрепите катетер швом 7-0 и снимите зажим с дистального отдела воротной вены.

Немедленно начните инфузию двух миллилитров интересующего реагента в течение 15-минутного периода доставки, с непрерывным контролем жизненных показателей животного на протяжении всего периода инфузии. Через час от начала ишемического времени снимите шов Поттса и катетер, затем пережмите шов 7-0 на задней ветви к воротной вене. Через два часа после начала реперфузии медленно набирайте 0,5 миллилитра крови из нижней полой вены, после чего медленно капельно переливайте кровь в новый флакон.

При необходимости слегка надавливайте, чтобы остановить кровотечение из вены. Затем центрифугируйте кровь и заморозьте половину сыворотки для последующей обработки, как только что было продемонстрировано. В экспериментальной конечной точке надрежьте диафрагму по кругу и разрежьте любую дополнительную соединительную ткань, которая остается, соединяя печень с брюшной полостью.

Соберите печень и возьмите четыре больших образца из левой и срединной долей, и четыре больших образца из правой доли. Затем поместите образцы в отдельные промаркированные флаконы и заморозьте ткани в жидком азоте для последующей обработки. Измерение уровня аланинаминотрансферазы в сыворотке крови у животных с нормальным физиологическим раствором и прикорневым зажимом ПЭГ-СОД демонстрирует значительную разницу между контролем сыворотки крови и уровнями экспрессии ферментов печени экспериментальных животных через 120 минут после реперфузии.

Экспрессия малонового диальдегида в тканевой неприкорневой зажимной доле не демонстрирует существенной разницы между контрольной и экспериментальной группами. Левая постприкорневой зажимная и реперфузионная доли, однако, демонстрирует значительно более высокий уровень экспрессии малонового диальдегида в тканях по сравнению с контрольной нереперфузной, неинфузионной долей, а также с правой долей, инфузией PEG-SOD. Такая же картина наблюдается и для экспрессии глутатиона в тканях.

Вестерн-блоттинг указывает на повышенный уровень экспрессии расщепленной каспазы-3 в левой доле после прикорневого зажима и реперфузии, который снижается у животных, получавших инфузию ПЭГ-СОД, различия, которые подтверждены денситометрией. После освоения этой техники ее можно выполнить за три часа 30 минут, если она выполнена правильно. При попытке выполнения этой процедуры важно помнить о получении существенного вытяжения на ветви воротной вены для канюляции при установке зажима дистальной воротной вены.

Как только эта процедура будет освоена, ее можно будет использовать для изучения влияния различных фармакологических веществ. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить канюляцию левой портальной венозной системы.