В Vitro модель для изучения клеточных трансформации, саркома Капоши герпеса

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить совместимый по возрасту и пассажу макет в инфицированных KSHV эндотелиальных клетках, чтобы можно было изучать KSHV-ассоциированные изменения в экспрессии генов клеток-хозяев, включая изменения, вызывающие злокачественную трансформацию, в контексте соответствующего контроля. Этот метод может помочь определить ключевые патофизиологические изменения в биологии клеток хозяина, которые приводят к KSHV-ассоциированному раку, тем самым выявляя новые терапевтические мишени для профилактики или лечения заболеваний. Основным преимуществом данной системы является то, что злокачественная трансформация эндотелиальных клеток после инфицирования KSHV происходит быстро и воспроизводимо, что позволяет изучать ранние события онкогенного процесса с контрольными клетками, соответствующими по возрасту и пассажу.

Хотя эта модель вирусного онкогенеза может дать представление о развитии саркомы Капоши, она также может быть применена к другим типам рака. Поскольку саркома Капоши является сосудистой опухолью, последствия этой модели клеточной культуры распространяются на понимание других патологических процессов заболевания, вызванных патологическим ангиогенезом. Для начала приготовьте и отфильтруйте стерилизованный буфер TNE, как описано в текстовом протоколе.

Затем храните раствор при температуре четыре градуса Цельсия. Культивировали KSHV положительную первичную лимфу выпотной лимфомы BCBL-1 в колбе T150, наполненной 60 миллилитрами среды RPMI. Поддерживайте в клетках температуру 37 градусов Цельсия 5% углекислого газа, чтобы получить суспензию примерно от 1 до 1,2 умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр.

Как только будет достигнута нужная плотность, разделите клетки по одной на две со свежей средой и добавьте PMA до конечной концентрации 20 нанограммов на миллилитр, чтобы вызвать производство KSHV. Затем инкубируйте культуры в течение пяти дней. После пяти дней инкубации соберите вирусные частицы, вращая клеточные суспензии в 300 раз больше g в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Центрифугируйте надосадочную жидкость еще раз при 2500 g при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы удалить клеточный мусор. Теперь, когда он очищен, налейте пять миллилитров 25%-ного раствора сахарозы в TNE с примерно 30 миллилитрами надосадочной жидкости в шесть ультрацентрифужных пробирок.

Центрифугируйте сбалансированные пробирки при 75 000 умноженных на g в течение двух часов при четырех градусах Цельсия под вакуумом. После завершения центрифугирования сцедите надосадочную жидкость и промокните край каждой пробирки, чтобы удалить как можно больше жидкости. Затем повторно суспендируйте гранулированный вирус в 150 микролитрах буфера TNE и объедините все образцы.

Тщательно перемешайте собранную суспензию и разделите ее на 25 микролитров аликвот. Храните стоковый вирус при температуре минус 80 градусов Цельсия. Культивирование первичных дермальных микрососудистых или лимфатических эндотелиальных клеток человека в среде EGM в колбе T75.

Поддерживайте клеточную культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока не будет достигнуто примерно 50% слияние. Перед трансдукцией эндотелиальных клеток культивировали клетки PA317 LXSN 16E6E7 в колбе для клеточных культур T150, заполненной 20 миллилитрами DMEM при 37 градусах Цельсия 5% углекислого газа. Как только будет достигнуто примерно 90% слияние, замените среду из клеточной культуры PA317 16 миллилитрами свежей среды и инкубируйте клетки в течение ночи.

После ночной инкубации соберите среду из клеточной культуры PA317 и осветите ее центрифугированием при 300 g в течение пяти минут при комнатной температуре. Замените среду EGM из 50% конфлюентной эндотелиальной клеточной культуры на 12 мл осветленной среды PA317. Инкубируйте клетки в течение четырех часов.

Затем замените шесть миллилитров среды PA317 шестью миллилитрами свежей среды EGM и инкубируйте клетки в течение ночи. После этого удалите среду из культуры эндотелиальных клеток и накормите клетки 12 миллилитрами свежей ЭМГ. Продолжайте инкубацию клеток еще в течение 48 часов.

Чтобы субкультивировать эндотелиальные клетки, удалите среду и промойте клетки 12 миллилитрами PBS, не содержащего катионов. Затем добавьте три миллилитра коммерческого раствора ферментативной диссоциации и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. Переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте клетки при 300-кратном g в течение пяти минут при комнатной температуре.

После гранулирования суспендируйте клетки в свежей среде EGM и равномерно разделите суспензию на три колбы T75. Отрегулируйте объем посевов до 12 миллилитров EGM на колбу. Затем добавьте 200 микрограмм на миллилитр G418, чтобы выбрать трансдуцированные эндотелиальные клетки.

Соберите трансдуцированные эндотелиальные клетки путем ферментативного расщепления, как было показано ранее. Ресуспендируйте гранулу эндотелиальных клеток в одном миллилитре среды EGM. Затем смешайте пять микролитров клеточной суспензии с 45 микролитрами раствора Трипанового синего и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра.

Затравите 2,5 раза по 10 до пятой жизнеспособных клеток в двух миллилитрах среды EGM на лунку шестилуночного планшета. На следующий день удалите среду EGM и промойте клетки в каждой лунке тремя миллилитрами PBS с кальцием и магнием. Затем добавьте в каждую лунку по два миллилитра среды EBM.

Чтобы заразить клетки KSHV, добавьте от пяти до 20 микролитров вирусного запаса в каждую лунку и перемешайте пластину, чтобы смешать суспензии. Добавьте равный объем TNE-буфера в каждую лунку, содержащую фиктивно инфицированные клетки. После центрифугирования планшета при 400 умноженных на г в течение 30 минут при комнатной температуре, инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение 90 минут.

Затем добавьте в каждую лунку по два миллилитра среды EGM и инкубируйте культуры в течение ночи. После инкубации удалите среду EGM из каждой лунки и замените ее двумя миллилитрами свежей EGM. Когда клетки достигают примерно 90% конфлюенции, собирайте их с помощью ферментативного пищеварения, как было показано ранее.

Соберите клетки из трех лунок в колбу T75 с маркировкой общего количества проходов в проходе после заражения. Перед тестированием или замораживанием раскройте фиктивные и инфицированные KSHV культуры эндотелиальных клеток, разделив их от одного до трех по крайней мере на два дополнительных пассажа. Здесь представлено микроскопическое изображение сливающихся псевдоинфицированных эндотелиальных клеток, демонстрирующее классический вид булыжника.

Клеточное деление в этих клетках подавляется при контакте, когда культура достигает слияния. Эндотелиальные клетки, инфицированные KSHV, развивают удлиненную веретенообразную морфологию, напоминающую веретенообразные клетки саркомы Капоши. В отличие от псевдоинфицированных клеток, эндотелиальные клетки, инфицированные KSHV, продолжают размножаться даже при достижении слияния, что приводит к развитию многослойных клеточных очагов.

При потере контакта с субстратом мок-инфицированные эндотелиальные клетки подвергаются апоптотической гибели клеток, анойкису, плюс они не образуют колонии в мягком агаре. Напротив, клетки, инфицированные KSHV, устойчивы к анойкису и растущим колониям при культивировании в мягком агаре. Развитие веретенообразной морфологии в инфицированных KSHV эндотелиальных клетках сопровождается экспрессией вирусного латентного белка ORF73 и в меньшей степени вирусного фактора процессивности ORF59.

При инфицировании KSHV BAC16, меченным зеленым флуоресцентным белком, эндотелиальные клетки развивали веретенообразную морфологию и демонстрировали экспрессию GFP, подтверждая случайную связь между инфекцией KSHV в наблюдаемом фенотипе. После своей разработки эта модель клеточной культуры проложила путь исследователям к оценке изменений мРНК и экспрессии белка клетки-хозяина, вызванных инфекцией KSHV. Следовательно, были выявлены ключевые патогенетические механизмы, лежащие в основе KSHV-опосредованного онкогенеза, представляющего собой перспективные терапевтические мишени.

Не забывайте, что KSHV является агентом BSL-2, и с ним следует обращаться с соблюдением соответствующих процедур и методов содержания биобезопасности.