Расширение наноструктурированных подложках с использованием стежка Техника для Nanotopographical модуляции клеточной поведения

Общая цель этой процедуры заключается в получении большой площади наноструктурированной подложки из небольших наноструктурированных форм с использованием простой и доступной, но универсальной техники стежка. Этот метод может помочь в изучении модуляции нанотопографии субстрата фенотипа и функции клеток на клеточном и молекулярном уровнях, таких как экспрессия белков фокальной адгезии. Главное преимущество данной методики в том, что она проста и экономически выгодна.

Для начала подготовьте силанизированную силиконовую форму в преполимере PDMS, как описано в текстовом протоколе. Поместите силанизированную силиконовую форму в 60-миллиметровую чашку Петри. Залейте преполимер PDMS на силиконовую форму в чашке Петри.

Поместите чашку Петри в пластиковый эксикатор и дегазируйте примерно на 10 минут, пока все пузырьки не исчезнут. Переложите чашку Петри на горячую плиту и отверждайте преполимер PDMS при температуре 70 градусов Цельсия в течение четырех часов. Осторожно отсоедините форму PDMS от силиконовой формы с помощью пинцета.

Определите ориентацию анизотропных наноузоров PDMS, таких как нанорешетки, под оптическим микроскопом и отметьте ее на обратной стороне форм PDMS маркером. Очистите силиконовую подложку этанолом в вытяжном шкафу, а затем просушите сжатым воздухом. Обрежьте неструктурированные участки каждой формы PDMS с помощью лезвия.

Пресс-формы PDMS должны быть выровнены как можно ближе, но не касаться окружающей формы, чтобы свести к минимуму неструктурированную область и избежать соприкосновения с деформацией наношаблона при приложении усилия компрессора. Поместите обрезанную форму PDMS наноузором лицевой стороной вниз на зеркальную сторону кремниевой подложки, а затем выровняйте другие формы близко, но не касаясь окружающих форм. Крайне важно попытаться отверждать PDMS в базальном слое, потому что неотвержденный PDMS может протекать через зазор между несколькими формами и повреждать наноузоры.

Тем не менее, полностью отвержденный PDMS не может соединить несколько форм вместе. Чтобы приготовить адгезивный слой PDMS, нанесите один грамм дегазированного преполимера PDMS на чистое предметное стекло с образованием слоя толщиной 0,5 миллиметра. Выпекайте слой PDMS при температуре 100 градусов Цельсия на горячей плите в течение трех-пяти минут.

С помощью иглы коснитесь слоя и убедитесь, что слой частично, но не полностью затвердел. Поместите слой PDMS на заднюю сторону выровненных пресс-форм PDMS, быстро переверните эту сборку и перенесите ее на горячую плиту. Приложите сжимающее усилие с помощью металлического блока в верхней части сборки, чтобы обеспечить хороший контакт между клеевым слоем PDMS и тыльной стороной пресс-форм PDMS.

Отверждайте клеевой слой PDMS при температуре 100 градусов Цельсия в течение одного часа. Выключите конфорку, снимите металлический блок и отсоедините форму PDMS с одинарным швом от силиконовой подложки. Чтобы нанести нанопечать сшитой формы PDMS в пластину из полистирола, поместите пластину из полистирола в алюминиевую распорку, установленную на трехдюймовой кремниевой пластине.

Нагрейте пластину PS на горячей плите при температуре 250 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем поместите сшитую форму PDMS наноузорами лицевой стороной вниз на расплавленную пластину PS. Далее поместите алюминиевую пластину на предметное стекло сшитой формы PDMS.

Приложите сжимающее давление, используя металлические блоки на алюминиевой пластине, и подождите три минуты. Поднимите и установите на место металлический блок с алюминиевой пластины, а также увеличьте сжимающее давление до 25 килопаскалей. Затем повторите этот шаг с давлением, увеличенным до 50 килопаскалей.

Поддерживайте температуру горячей плиты на уровне от 240 до 250 градусов Цельсия при постоянном давлении 50 кПа в течение 15 минут. Выключите конфорку и охладите всю установку. Снимите металлические блоки после того, как температура опустится ниже 50 градусов по Цельсию, и осторожно снимите сшитую форму PDMS с пластины PS.

Чтобы нанести нанопечать формы PDMS на тонкую пленку PS, поместите сшитую форму PDMS с нанотопографией лицевой стороной вниз на тонкую пленку PS, которая установлена на горячую пластину. Прикладывайте сжимающее давление в 12 кПа к пресс-форме PDMS с помощью металлических блоков на предметном стекле пресс-формы PDMS. Увеличьте температуру конфорки до 180 градусов по Цельсию, и поддерживайте ее в течение 15 минут.

Выключите конфорку и охладите всю установку. Снимите металлические блоки после того, как температура опустится ниже 50 градусов по Цельсию, и аккуратно снимите сшитую форму PDMS с пленки PS. Используя полый стальной арочный пуансон, разрежьте наноструктурированные подложки PDMS на диски, чтобы они соответствовали конфигурации конкретной многолуночной пластины.

Затем с помощью пинцета поместите диски PDMS в лунки многолуночного планшета. Стерилизуйте подложки PDMS с использованием 70% этанола в течение 30 минут. После этого аспирируйте этанол, а затем подвергайте его воздействию ультрафиолета в течение 30 минут.

Промойте субстраты PDMS стерильным фосфатно-солевым буфером 1X три раза. Затем покройте субстраты PDMS белком внеклеточного матрикса в течение 30 минут при комнатной температуре. Трижды промойте субстраты PDMS стерильным PBS, каждый раз в течение пяти минут.

Суспензируйте клетки рака легких человека A549 в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium с 10% фетальной бычьей сывороткой и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Пластинчатые ячейки с плотностью затравки 2 000 клеток на квадратный сантиметр на подложках PDMS. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, в течение одного дня, а затем наблюдайте за ними.

Здесь показан сгенерированный наноузор на пластине PS и тонкой пленке. Стрелками отмечен полимерный выступ в междоузлиях сшитых пресс-форм PDMS. Эти изображения SEM демонстрируют, что подложки, работающие с PDMS, точно переносятся из наношаблона, написанного электронно-лучевой литографией, с применением техники стежка.

Здесь представлены репрезентативные СЭМ-изображения клеток A549, выращенных на нанорешетках и наностолбах. Клетки демонстрируют выровненную клеточную морфологию на нанорешетках, в то время как клетки хаотично распространяются на наностолбах. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создать большую площадь наноструктурированной подложки путем сшивания нескольких небольших определенных наноформ.

Не забывайте, что работа с толуолом и параформальдегидом может быть крайне опасной, поэтому во время проведения процедур всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты.