Количественный 3D В Silico Моделирование (q3DISM) церебрального бета-амилоида Фагоцитоз в моделях грызунов болезни Альцгеймера

Общая цель этого количественного трехмерного моделирования in silico, или метода q3DISM, заключается в количественной оценке поглощения бета-амилоида мононуклеарными фагоцитами в мозге грызунов, моделирующих болезнь Альцгеймера. Этот метод удовлетворяет насущную потребность в области исследований болезни Альцгеймера для количественной оценки клиренса бета-амилоида, который откладывается в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера, образуя старческие бляшки. Впервые этот метод позволяет реконструировать и количественно оценить бета-амилоид макрофагами in vivo Мы начали использовать 3-Dism для изучения отложения бета-амилоида, потому что нам нужен был надежный инструмент для визуализации и количественного определения фагоцитоза микрофагов in vivo.

Этот метод может оказаться полезным при тестировании экспериментальных методов лечения болезни Альцгеймера, чтобы оценить, какие препараты стимулируют макрофаги для эффективного клиренса бета-амилоида. Когда образцы тканей готовы к иммуноокрашиванию, заполните область ткани, окруженную пером, гидрофобным барьером блокирующим буфером для одночасовой инкубации при комнатной температуре во увлажненной камере. В конце инкубации замените блокирующий буфер первым первичным антителом, представляющим интерес, на ночь при температуре 4 градуса Цельсия в увлажненной камере.

На следующее утро промойте образцы в трех пятиминутных ваннах PBS при комнатной температуре с легким перемешиванием. После третьего промывки инкубируйте предметные стекла с соответствующими флуоресцентными вторичными антителами при комнатной температуре, защищенной от света. Через час промойте срезы еще три раза в защищенном от света ПБС.

Затем пометьте клетки другими тканевыми первичными и вторичными антителами, представляющими интерес, в течение следующих двух-четырех дней, как показано выше. Для эффективного окрашивания клеточных и суперклеточных компартментов и отложений бета-амилоида крайне важно мечить только одним первичным антителом за раз, за которым следует соответствующее вторичное антитело. Трудоемкий, но оптимизирующий результат процесс.

После последнего окрашивания вторичными антителами дайте срезам полностью высохнуть в течение ночи при комнатной температуре в темноте. Затем накройте высушенные образцы защитным чехлом, герметизированным флуоресцентным монтажным материалом, содержащим DAPI. Чтобы получить изображение образцов с помощью конфокальной микроскопии, выберите объектив 60-кратного микроскопа и добавьте в линзу иммерсионное масло.

Поместите образец на держатель предметного стекла микроскопа и поднимите объектив до тех пор, пока масло не соприкоснется со предметным стеклом. Используя эпифлуоресцентное освещение, отрегулируйте фокальную плоскость, чтобы найти амилоидные бляшки в гиппокампе или коре головного мозга. Затем получите конфокальные изображения активированных мононуклеарных фагоцитов, окружающих амилоидные отложения в гиппокампе или коре головного мозга.

Для качественного 3D-моделирования in silico сначала проанализируйте конфокальные наборы данных с научной обработкой 3D-изображений в программном модуле колокализации анализа на предмет пространственной близости окрашивания активированного маркера макрофагов во всех Z-плоскостях одновременно. Создание каналов колокализации, соответствующих окрашиванию фаголизосомы в активированных мононуклеарных фагоцитах. Выберите TRITC для канала A и FITC для канала B.In в окне Проверка режима выберите Threshold.

Для интенсивности колокализации выберите «Исходные каналы». Нажмите кнопку Редактировать, чтобы выбрать цвет колокализации. Затем отрегулируйте пороговые значения для каждого канала независимо, чтобы включить конкретное окрашивание и исключить фоновые и неспецифические сигналы.

Колокализованные вокселы будут отображаться выбранным цветом колокализации во всех z-стеках одновременно. Затем нажмите Построить канал колокализации. Созданный колокализатонный канал появится в окне Настройка отображения.

Нажмите на канал колокализации, чтобы открыть статистику канала. Процентное содержание объемного материала А выше порогового значения колакализовано представляет собой объем моноцитов, занимаемый фаголизосомами. С помощью модуля «Колокализация» проанализируйте канал колокализации на предмет пространственной близости с сигналами бета-амилоида для количественной оценки бета-амилоида, инкапсулированного в фаголизосомах.

Выберите набор данных колокализации Channel A и Cy5 для Channel B и постройте канал колокализации, как показано выше. Нажмите на канал колокализации, чтобы снова открыть статистику канала. Процент объемного материала А выше порогового колокализованного представляет собой фаголизосомальный объем, занимаемый бета-амилоидом.

С помощью модуля Surpass реконструируйте стеки конфокальных изображений и сгенерируйте 3D-модели инкапсулированного бета-амилоида в фаголизосомах моноцитов. В окне "Настройка дисплея" выберите TRITC, чтобы отобразить только окрашивание макрофагов, и нажмите "Добавить новую поверхность" в свойствах объема. В разделе «Настройки» на первом из пяти шагов алгоритма выберите «Поверхность».

В поле Цвет выберите интересующий вас тип цвета и настройте прозрачность соответствующим образом. Затем поставьте галочку в поле «Выбрать область интереса» и нажмите «Далее». На втором шаге из пяти, область интереса, настройте координаты X, Y и Z, чтобы нарисовать окно вокруг интересующей клетки, и нажмите далее.

На третьем шаге из пяти, исходный канал, выберите исходный канал TRITC и установите флажок «Сглаживание». Установите уровень детализации площади поверхности на 0,4 микрона и щелкните далее. На четвертом шаге из пяти, пороге, отрегулируйте порог так, чтобы создаваемый объем идеально перекрывался с сигналом канала TRITC и нажмите далее.

Наконец, на пятом шаге из пяти классифицируйте поверхности, в разделе «Типы фильтров» выберите объекты в зависимости от их размера, которые будут включены или исключены из создаваемых объемов. Повторите те же шаги для создания трехмерных поверхностей для фаголизосом с каналом FITC и бета-амилоида с каналом Cy5. После качественного 3-D моделирования in silico, как только что было продемонстрировано, можно проанализировать поглощение бета-амилоида в фаголизосомах моноцитов в мозге трансгенных мышей и крыс.

Интересно, что объем, занимаемый CD68-положительными фаголизосомами, значительно увеличен в Iba1-положительных мононуклеарных фагоцитах, связанных с удаленными от бляшек, как у мышей, так и у крыс, что свидетельствует о том, что мононуклеарные фагоциты вблизи бляшек готовы к фагоцитозу, по сравнению с клетками, расположенными вдали от бляшек. Следует также отметить, что мононуклеарные фагоциты, ассоциированные с бляшками, демонстрируют повышенное поглощение бета-амилоида у трансгенных мышей по сравнению с клетками, удаленными от бляшек, в то время как у трансгенных крыс в целом наблюдается очень скромное поглощение бета-амилоидных фибрилл, без видимых изменений в фагоцитозе бета-амилоида в зависимости от расстояния от бляшек. При выполнении этой процедуры важно помнить, что качество конфокальных изображений имеет решающее значение и что во время анализа колокализации для всех каналов должны применяться одинаковые пороговые значения.

С момента своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейровоспаления к изучению фагоцитарных событий в мозге грызунов, моделирующих болезнь Альцгеймера. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как маркировать участки мозга грызунов на мононуклеарные фагоциты, фаголизосомы и бета-амилоид. Количественно оценить фагоцитоз церебрального бета-амилоида в 3-D in vivo.