Индуцибельные LAP-меченый Стабильные клеточные линии для исследования белка функции, пространственно-временной локализации и белковое взаимодействие сетей

Общая цель этой процедуры заключается в создании индуцируемой локализации и аффинной очистки, или LAP-меченых стабильных клеточных линий, для исследования функции белка, пространственно-временной локализации и сетей взаимодействия белков. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы молекулярной и клеточной биологии, связанные с функцией белка, локализацией белкового клеточного цикла ниже нуля и белковыми взаимодействиями. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он поддается высокопроизводительному анализу групп белков, а также может быть использован для препарирования белковых компонентов биологических путей.

Чтобы начать эту процедуру, клонируйте открытую рамку считывания интересующего гена в вектор, помеченный LAP, и трансфектируйте его в клетки HEK293, как описано в текстовом протоколе. Через день после трансфекции замените отрицательную среду Tet DMEM/F12 на свежую среду. Через два дня после трансфекции расщепите клетки до 25% конфлюенции.

Дайте клеткам прикрепиться примерно пять часов. Затем добавьте гигромицинсодержащую среду за вычетом Tet DMEM/F12 в заданной концентрации. Для клеток HEK293 используйте 100 микрограммов на миллилитр гигромицина.

Заменяйте среды по мере необходимости до тех пор, пока не появятся отчетливые клеточные очаги, напоминающие непрозрачные пятна на фоне прозрачной пластины. Добавьте 20 микролитров трипсина поверх каждого клеточного очага и дважды проведите его вверх и вниз с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров. Перенесите клетки в 24-луночный планшет и размножите клетки путем непрерывного роста в гигромицинсодержащей среде за вычетом Tet DMEM/F12.

Расширьте валидированную LAP-меченую клеточную линию для тандемной аффинной очистки, или TAP, выделения белковых комплексов. Для этого постоянно пропускайте все элементы HEK293 в более крупные планшеты и/или роликовые бутылки с вычетом среды Tet DMEM/F12 при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах углекислого газа. Для индуцируемых Tet/Dox клеточных линий индуцируйте клетки в течение 10-15 часов, добавляя концентрацию 0,2 мкг на миллилитр Tet/Dox, когда клетки достигают примерно 70% конфлюенции.

Соберите клетки путем перемешивания или трипсинизации. Затем гранулируйте их в 875 раз больше г в течение пяти-10 минут. Чтобы соединить антитела против GFP с гранулами белка А, уравновесьте 160 микролитров гранул белка А в упакованном объеме с PBST в пробирке объемом 1,5 миллилитров.

Вымойте бусины три раза с 1 миллилитром PBST. После каждого этапа промывки на протяжении всей этой процедуры шарики центрифугируются при 5000 g в течение 10 секунд, а надосадочная жидкость удаляется. После повторного суспендирования гранул в 500 микролитрах PBST добавьте 80 микрограммов аффинного очищенного быстрого антитела против GFP в каждую пробирку, содержащую 160 микролитров гранул.

Перемешивайте в течение часа при комнатной температуре. Промойте бусины два раза одним миллилитром PBST, затем промойте бусины два раза одним миллилитром 0,2 моляра бората натрия, pH После окончательной промывки добавьте 900 микролитров буфера бората натрия, чтобы довести окончательный объем до одного миллилитра. Затем добавьте 100 микролитров 220 моляров DMP в суспензию гранул, чтобы конечная концентрация составила 20 миллимоляров.

Осторожно вращайте трубки при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации с ДМП промойте шарики один раз одним миллилитром 0,2 молярного этаноламина, 0,2 моляра натрия хлорида pH 8,5, чтобы инактивировать остаточный сшивающий агент. Затем снова суспензируйте бусины в одном миллилитре того же буфера, и вращайте в течение одного часа при комнатной температуре.

После гранулирования шариков повторно суспендируйте их в дополнительных 500 микролитрах буфера. Приготовленные бусины стабильно держатся в течение нескольких месяцев при четырех градусах Цельсия. Чтобы получить клеточные лизаты, повторно суспендируйте 500 микролитров упакованного клеточного объема в 2,5 миллилитра LAP 300, с 0,5 миллимолярного DTT и ингибиторами протеазы.

Добавьте 90 микролитров 10% нонилфеноксиполиэтоксиэлэтанола и перемешайте методом инверсии. Выложите смесь на лед на 10 минут. Центрифуга при 21 000 раз g в течение 10 минут.

После центрифугирования соберите эту низкоскоростную надосадочную жидкость и отложите образец объемом 10 микролитров для анализа геля. После переноса низкоскоростного надосадочной жидкости в трубку TLA 100,3 вращайте при 100 000 g в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Соберите эту высокоскоростную надосадочную жидкость в пробирку и положите на лед, зарезервировав образец объемом 10 микролитров для анализа геля.

Для первого аффинного захвата путем связывания с анти-GFP гранулами предварительно элюируйте гранулы, связанные с антителами, промыв их три раза одним миллилитром элюирующего буфера для удаления несвязанных антител и уменьшения фона. Выполните это быстро. Не оставляйте бусины в высокой соли надолго.

Затем трижды промойте шарики одним миллилитром LAP 200 N. Затем смешайте экстракт надосадочной жидкости с гранулами антител в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования экстракта при 21 000 г в течение 10 минут оставьте образец надосадочной жидкости объемом 10 микролитров для анализа геля. Выполните три быстрых промывки бусин одним миллилитром LAP 200 N, содержащим 0,5 миллимолярного DTT и ингибиторы протеазы.

Используйте один и тот же буфер для промывки бусин еще два раза с пятиминутным временем инкубации для каждой стирки. Затем быстро промойте бусины еще два раза 1 миллилитром LAP 200 N, содержащим 0,5 миллимоляра DTT и не содержащим ингибиторов протеазы, прежде чем добавить протеазу Tobacco Etch Virus, или TEV. Добавьте в бусины 10 микрограммов протеазы TEV в одном миллилитре LAP 200 N и вращайте трубки на четыре градуса Цельсия в течение ночи.

На следующий день гранулируйте шарики и переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку. Дважды промойте шарики 160 микролитрами LAP 200 N, содержащим 0,5 миллимоляра DTT и ингибиторы протеазы, чтобы удалить остатки белка. Для второго захвата аффинности через связывание с S-белком агарозой промойте одну пробирку 80 микролитров агарозной суспензии S-белка три раза одним миллилитром LAP 200 N. Добавьте выделенную TEV надосадочную жидкость к шарикам S-белка и раскачивайте их в течение трех часов при четырех градусах Цельсия.

После гранулирования шариков промойте их три раза одним миллилитром LAP 200 N, содержащим 0,5 миллимоляра DTT и ингибиторы протеазы. Затем два раза промойте бусины одним миллилитром LAP 100. Выбавьте белки из агарозы S-белка, добавив 50 микролитров 4-кратного буфера для образцов Laemmli и нагревая до 97 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Чтобы идентифицировать взаимодействующие белки с помощью масс-спектрометрического анализа, проверьте качество очистки, проанализировав собранные образцы методом электрофореза в геле с додецилсульфатом натрия. Серебристым пятном нанесите полученный гель. Кроме того, иммунную блоттинг элюируют и прозондируйте антитела против GFP, чтобы убедиться, что очищение, помеченное LAP, работает.

Чтобы идентифицировать стехиометрические и субстехиометрические соочищающие вещества, возьмите окончательный образец элюирования и разделите его с помощью SDS-PAGE. Окрасьте гель белоковым красителем, совместимым с масс-спектрометрией. Вырежьте наиболее заметные полосы в геле и пространство между ними, чтобы обработать полосы отдельно для анализа методом масс-спектрометрии.

Здесь представлен репрезентативный вестерн-блоттинг образцов белков из неиндуцированных и Dox-индуцированных клеток LAP-Tau HEK293. Клетки зондируют антителами против тубулина для обнаружения контроля загрузки тубулина и зондируют с помощью анти-GFP для обнаружения меченного LAP тау-белка. Обратите внимание, что LAP-Tau экспрессируется только тогда, когда клетки индуцируются с помощью Dox.

Митотические клетки, экспрессирующие LAP-Tau, фиксировали и окрашивали на ДНК и тубулин антитубулиновыми антителами, а субклеточную локализацию LAP-Tau анализировали методом флуоресцентной микроскопии. Обратите внимание, что LAP-Tau локализуется на митотическом веретене и полюсах веретена во время митоза. Здесь представлен типичный окрашенный серебром гель очистки LAP-Tau.

Дорожки представляют молекулярную массу, очищенные лизаты и конечные элуаты. Образцы наносили на 4-20% гель SDS-PAGE и окрашивали в серебро для визуализации очищенных белков. Обратите внимание, что полоса, соответствующая LAP-Tau, отмечена звездочкой, и можно увидеть несколько других полос, соответствующих коочищающим белкам.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создавать индуцируемые стабильные клеточные линии, меченные LAP, и как проводить биохимическую очистку LAP-меченных белков для протеомного анализа и идентификации сетей взаимодействия белков.