Сравнительное исследование наркотиков Способы доставки ориентированы на внутреннем ухе мышей: Bullostomy Versus Transtympanic Инъекции

Общая цель данной работы — описать и сравнить два микрохирургических подхода к локальной доставке лекарств во внутреннее ухо с точки зрения влияния на параметры слуха и маркеры цитоархитектоники улитки. Эти процедуры могут помочь нам ответить на ключевые вопросы в области слуха, особенно при разработке прохимических исследований на животных. Главное преимущество этих методик заключается в том, что они малоинвазивны.

И это позволяет веществу дидактически достигать внутреннего уха. Применение этих методов распространяется и на терапию тугоухости, поскольку микрохирургические процедуры подходят для сухого родоразрешения в среднем ухе. Мирная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что буллостомия и транстимпанальная инъекция сложны в освоении и требуют анатомических знаний и хирургической подготовки.

Для начала поместите беруш в контралатеральное ухо мыши, находящейся под наркозом, чтобы получить преимущественно моноауральные реакции. Затем поместите мышь в положение лежа на грелку в звукопоглощающей камере. Поместите положительный подкожный игольчатый электрод из нержавеющей стали в кожу головы между ушами над макушкой черепа.

Поместите электрод сравнения в околоушную область ниже ушной раковины. Затем поместите заземляющий электрод в область спины, хвоста или задней конечности. Проверьте электрическое сопротивление в положительном и отрицательном электродах.

Убедитесь, что импеданс составляет менее трех килоом. Расположите предварительно заполненный динамик на фиксированном расстоянии от выбранного уха так, чтобы центр динамика был выровнен по внешнему слуховому проходу. Убедитесь, что между динамиком и ухом нет препятствий, а ушная раковина полностью открыта.

Подключите цифро-аналоговый выход рабочей станции к выбранной акустической системе. Здесь используются динамики со свободным полем. Подключите к аналого-цифровому входу усилитель с низким уровнем шума и хорошим соотношением сигнал/шум.

Затем начните процесс подачи акустических стимулов во внешний слуховой проход с помощью предустановленных стимулов или новых сигналов, разработанных с помощью соответствующего программного обеспечения. Предъявляйте стимулы, начиная с высокой интенсивности и уменьшая интенсивность с шагом от 5 до 10 децибел уровня звукового давления. Запишите электрическую реакцию в первые 10 миллисекунд после стимуляции, так как вызванные реакции ABR появляются через шесть-восемь миллисекунд.

Используйте программное обеспечение для определения порога ABR, как описано в письменной части протокола. После введения анестезии в соответствии с утвержденными протоколами проверьте достижение хирургической плоскости анестезии за счет отсутствия реакции на защемление пальца ноги и появления регулярного дыхания. Используйте машинки для стрижки, чтобы удалить шерсть на вентральной поверхности шеи и защитить глаза от роговичного кератита с помощью геля на основе гидрокси-пропил-метилцеллюлозы.

Поместите мышь в стерильную операционную область в положение лежа на спине. Очистите кожу антисептическим раствором на основе повидон-йода и накройте стерильной простыней. С помощью скальпеля сделать двухсантиметровый продольный разрез от нижней челюсти до ключицы, посмотреть в операционный микроскоп и выявить подчелюстные железы.

Отделите обе подчелюстные железы щипцами, втяните их, а в лицевом нерве локализуйте начало двучелюстной мышцы. Затем сделайте разрез в начале двужелудочной мышцы ножницами и втяните его вентрально, обнажив нижележащую нижнюю медиальную часть барабанной буллы. Затем с помощью иглы 27-го калибра просверлите буллу и создайте отверстие.

Удалите кровь с просверленного участка с помощью рассасывающейся желатиновой губки. Расположите стапедиальную артерию в круглом окне мембраны, прижатой к ней. Используя катетер 34-го калибра и стеклянный микрошприц, медленно введите от трех до пяти микролитров раствора транспортного средства через буллостомию и непосредственно в круглую оконную нишу, чтобы заполнить ее.

Заклейте буллостомию одной-двумя каплями тканевого клея. Верните подчелюстные железы в исходное положение, а разрезы кожи закройте шелковым хирургическим швом 5-0. Нанесите вокруг разреза антисептик на основе повидон-йода или хлоргексидина, чтобы избежать инфицирования раны.

Держите мышь на грелке до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной. Возвращайте животное в домашнюю клетку только после того, как оно полностью восстановится. Поместите мышь в положение бокового пролежня и подготовьте в септической хирургической области ниже наружного слухового прохода, как показано ранее.

После выполнения продольного разреза шириной 0,5 сантиметра в вертикальной части наружного слухового прохода с помощью хирургического микроскопа определите местоположение барабанной перепонки. Определите верхнюю pars flaccida в нижней pars tensa, которая разделена на переднюю и заднюю части ручкой malleus. Затем сделайте небольшую мирингостомию в каудальной части pars flaccida и дополнительный разрез в pars tensa барабанной перепонки, чтобы обеспечить эвакуацию воздуха во время инъекции.

С помощью стеклянного микрошприца, подключенного к катетеру 34-го калибра, осторожно введите от 10 до 15 микролитров средства через pars flaccida, расположенную рядом с круглой оконной нишей, до тех пор, пока среднее ухо не будет явно заполнено. Закройте разрезы кожи шелковым хирургическим швом 5-0 и очистите, как описано ранее. На этом графике показаны пороги ABR у самцов 8-недельных мышей C57BL/6J в ответ на клик-стимулы до операции и через семь, 14 и 28 дней после микрохирургии.

Данные буллостомии показаны оранжевым цветом, данные транстимпанальной инъекции — синим, а данные неоперированных животных — серым. На этом графике показаны пороги ABR в ответ на тоновые стимулы в диапазоне от восьми до 40 килогерц за тот же период времени после микрохирургии. Опять же, не наблюдалось существенных различий между буллостомией и транстимпанальным доступом.

Морфологические исследования показывают, что среда Scala не показывает изменений после доставки транспортного средства с помощью буллостомии или транстимпанальной инъекции, что указывает на то, что ни одна из этих процедур сама по себе не приводит к повреждению. Пытаясь провести буллостомическую операцию, важно помнить о критической и анатомической структуре, окружающей среднее и внутреннее ухо грызунов. После этих процедур могут быть выполнены другие методы.

После своего развития эти методы открывают путь исследователям в области слуховой нейробиологии к изучению потенциальных местных методов лечения на животных моделях, в основном на грызунах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как вводить препараты в среднее ухо и как оценивать слух у грызунов.