Определение жирных кислот в Эхиноцереус бациллы

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы идентифицировать жирные кислоты из бактерий и определить положение метильного ветвления и двойных связей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области бактериологии, такие как роль жирных кислот в том, как бактерии адаптируются к окружающей среде. Основное преимущество этой методики заключается в том, что не требуется пролификация жирных кислот.

Применение этого метода распространяется на бактериальную идентификацию из-за важности состава жирных кислот в бактериальной таксономии. Хотя этот метод был разработан на бактерии Bacillus cereus, он также очень актуален для изучения других видов, содержащих жирные кислоты с разветвленной цепью. Вообще, при освоении этого метода у нас были проблемы.

Потому что современные методы идентификации жирных кислот не идентифицируют метильное ветвление в положении двойной связи. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте газон от бактерий, разложив 100 микролитров в течение ночи культуру штамма, инкубированную при 30 градусах Цельсия в LB, по поверхности пластины агаровой среды. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия.

Чтобы получить липидные жирные кислоты, собирайте бактериальные клетки, соскребая колонии с агаровой пластины. И перекладывая примерно 40 миллиграмм в десятимиллилитровую стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой и уплотнением из ПТФЭ. Чтобы выполнить переэтерификацию, добавьте пять миллилитров 0,2 молярного гидроксида калия в метаноле к свежим бактериальным клеткам.

Vortex, и инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. После этого добавьте один миллилитр одной молярной аскетической кислоты, чтобы понизить pH до семи. Теперь добавьте три миллилитра гексана и вортекс в течение одной минуты, чтобы извлечь метиловые эфиры жирных кислот или FAME.

Перенесите верхнюю фазу в чистые пробирки и сконцентрируйте путем выпаривания при комнатной температуре под непрерывным потоком азота для получения примерно 200 микролитров экстракта FAME. Затем переложите экстракты во флаконы GC с вкладышами. Вводите экстракты в газовую хроматографическую масс-спектрометрию, или систему ГХ-МС, оснащенную капиллярной колонкой.

Установите температуру порта впрыска на 250 градусов Цельсия. Подержите температуру духовки на уровне 50 градусов Цельсия в течение одной минуты. Увеличьте до 190 градусов Цельсия со скоростью 20 градусов Цельсия в минуту и увеличьте до конечной температуры 230 градусов Цельсия со скоростью два градуса Цельсия в минуту.

Для МС запишите масс-спектры методом ионизации электронов, или ЭИ, при напряжении 70 электрон-вольт, и установите полный ионный ток в диапазоне от 50 до 400 атомных единиц массы, или АМУ. Растворите образец высушенного экстракта FAME в одном миллилитре сухого дихлорметана. Затем добавьте раствор экстракта и 0,2 миллилитра 3-пиридинеметанола к 0,1 миллилитров одного моляра трет-бутоксида калия в тетрагидрофуран.

Нагрейте раствор до 40 градусов Цельсия в течение 30 минут в закрытом флаконе. После остывания раствора до комнатной температуры добавьте два миллилитра очищенной деионизированной воды и четыре миллилитра гексана. Перемешайте раствор в течение одной минуты с помощью вихревого миксера.

Дав фазам разойтись, соберите верхнюю органическую фазу. Далее добавляйте безводный сульфат натрия до тех пор, пока органическая фаза не станет прозрачной. Перенесите органическую фазу в чистую пробирку, затем выпарите органическую фазу под потоком азота до тех пор, пока объем не достигнет примерно 200 микролитров.

Добавьте 250 мг 2-амино-2-метил-1-пропанола в образец высушенного экстракта FAME. Промойте трубку азотом и закройте ее пробкой. Затем нагрейте раствор до 190 градусов Цельсия на ночь.

После остывания раствора до комнатной температуры добавьте три миллилитра дихлорметана и пять миллилитров очищенной деионизированной воды. Сделайте смесь вихревой и дайте фазам разойтись. Затем удалите водную фазу.

После этого промойте органическую фазу пятью миллилитрами воды. Добавляйте безводный сульфат натрия до тех пор, пока органическая фаза не станет прозрачной. После переноса органической фазы в новую пробирку выпарить ее под струей азота до достижения объема примерно в 200 микролитров.

Масс-спектр пиколинового производного I16 подтверждает метильное ветвление. Зазор между ионами 28 AMU на 304 и 332 соответствует фрагментам, образовавшимся до и после разветвленного углерода. Здесь показаны диагностические ионы 113 и 126, характерные для производных DMOX.

Молекулярный ион 307 характерен для изомера 16:1, а зазор в 12 AMU между 196 и 208 указывает на двойную связь с углеродом. Зазор в 12 AMU больше не наблюдается, когда двойная связь находится перед углеродом 7. Интенсивный ион 153, характеризующийся двойной связью на углероде 5, и молекулярный ион 307 в масс-спектре производного DMOX идентифицировали это соединение как n16 one delta five.

307 ион производного DMOX и 345 ион пиколинала указывают на изомер жирных кислот 16:1. Зазор 28 AMU указывает на положение ветвления, а зазор 12 AMU для DMOX и 26 AMU для пиколинового эфира указывает на двойную связь. Жирные кислоты и соответствующие диагностические ионы, идентифицированные в Bacillus cereus, перечислены здесь.

Диагностические ионы идентифицируют метильное ветвление и двойную связь на углеродной цепи для производных DMOX и пиколинового эфира. После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она выполнена правильно. После этой процедуры жирные кислоты могут быть количественно определены с помощью GC-MS и высвобождения производных FAME.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области бактериологии к изучению бактериального разнообразия и механизмов бактериальной адаптации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изучать жирные кислоты в бактериях, включая метильные разветвленные и ненасыщенные жирные кислоты. Не забывайте, что работа с реагентами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа с лабораторным вытяжным шкафом и ношение перчаток.