Анализ окружающей среды твердые частицы-индуцированных хромосомных аберраций Использование номера In Vitro система

Общая цель этого эксперимента заключается в обнаружении хромосомных повреждений, вызванных воздействием на клетки твердых частиц, извлеченных из окружающего воздуха. Этот метод может помочь ответить на один ключевой вопрос в области твердых частиц, а именно: вызывает ли воздействие твердых частиц повреждение хромосом? Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет напрямую визуализировать повреждения, вызванные в генетическом материале.

После сбора и анализа частиц в соответствии с текстовым протоколом проведите воздействие частиц путем нагревания полной питательной среды, 0,25% трипсина и PBS на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, не менее чем за 30 минут до начала культивирования. После промывания сырых 264,7 клеток добавьте в посуду один миллилитр теплого раствора трипсина и вытесните клетки со дна сосуда для культуры тканей путем соскабливания. Затем соберите клетки и сделайте одноклеточную суспензию путем повторного пипетирования.

С помощью трипанового синего подсчитайте количество клеток, затем используйте предварительно подогретую полную среду, чтобы наложить на них плотность 8000 на квадратный сантиметр в 100-миллиметровой чашке для культуры тканей. Затем используйте готовую среду для регулировки объема до 10 миллилитров для конечной концентрации 50 000 клеток на миллилитр. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 24 часов, чтобы они могли прикрепиться.

В шкафу биобезопасности используйте стерильный PBS для разбавления отфильтрованных частиц в концентрации 0,5 мг на миллилитр для дозы лечения 5 микрограмм на миллилитр и при дозе 5 мг на миллилитр для дозы обработки 50 микрограмм на миллилитр. Чтобы обработать клетки твердыми частицами, проверьте культивируемые клетки под микроскопом с 10-кратным увеличением на предмет роста клеток, морфологии клеток, состояния культуры и контаминации. На этом этапе клетки должны быть слиты не менее чем на 30%.

С помощью стерильной пипетки асептически аспирируйте среду и используйте два миллилитра PBS при температуре 37 градусов Цельсия для двукратной промывки емкости для культивирования. Добавьте заранее определенную дозу твердых частиц со свежей средой и инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 для параллельной экспозиции, используемой для одновременного генотоксического и эпигенотоксического анализа. Чтобы остановить клетки в метафазе, после промывки клеток добавляют в культуру два миллилитра предварительно подогретой среды с пятью микролитрами на миллилитр раствора колцемида и инкубируют при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение двух часов.

После инкубации полностью удалите среду и с помощью теплой PBS промойте клетки два раза. Затем добавьте раствор трипсина и инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты. С помощью скребка для клеток отделите клетки и добавьте 10 миллилитров PBS, чтобы инактивировать трипсин.

Затем пипеткой вверх и вниз по меньшей мере десять раз, чтобы создать суспензию одиночных клеток, и перенесите клетки в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Поместите пробирки в откидную центрифугу и вращайте клеточную суспензию при 400-кратном перегрузке и комнатной температуре в течение пяти минут. Для проведения гипотонического лечения следует извлечь надосадочную жидкость из пробирок, не нарушая клеточную гранулу, и оставить примерно 0,5 миллилитра PBS.

Аккуратно разбейте клеточную гранулу и с помощью пипетки P200 сделайте одноклеточную суспензию. Затем добавьте четыре миллилитра предварительно подогретого раствора хлористого калия по каплям, слегка встряхивая. Инкубируйте клеточную суспензию на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.

После гипотонического лечения зафиксируйте клетки, добавив в трубку равный объем фиксатора, и аккуратно перемешайте, перевернув трубку. Центрифугируйте пробирки при 400-кратном g при комнатной температуре в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость. На этой стадии клеточная гранула увеличится в размерах и станет белесой по цвету и более заметной.

Удалите надосадочную жидкость. Добавьте четыре миллилитра свежего фиксатора, и выдержите трубки при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем центрифугируйте пробирки, удалите надосадочную жидкость и используйте четыре миллилитра фиксатора, чтобы промыть клетки еще два раза.

Полностью погрузите стеклянные горки в 10% жидкое моющее средство на 30 минут. Затем тщательно промойте горки в холодной проточной воде из-под крана в течение 30 минут. Используйте дистиллированную воду для трех промывки слайдов, чтобы полностью удалить моющее средство.

Затем погрузите их в дистиллированную воду, а горки храните в холодильнике на ночь. Капните десять микролитров клеточной суспензии на охлажденное влажное предметное стекло и дайте ему высохнуть в течение ночи при комнатной температуре. Чтобы окрашивать и монтировать образцы, приготовьте 50 миллиметров раствора для окрашивания гимзы, смешав одну часть раствора для окрашивания гимзы, с одной частью PBS, и вылейте в банку с коплином.

Погрузите слайды в раствор для окрашивания на 20 минут, затем промойте слайды в дистиллированной воде, чтобы удалить излишки пятна, и сразу же используйте фен для сушки слайдов. Оставьте горки при комнатной температуре на ночь. На следующее утро нанесите одну каплю монтажного средства на предметное стекло.

Аккуратно поместите сверху защитный колпак и дайте монтажному материалу медленно распространиться по слайду. Затем используйте бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю среду. Наконец, используйте светлопольный микроскоп со 100-кратным увеличением для изучения структурных хромосомных аберраций в метафазных размахах.

На этом изображении показано, что нормальное метафазное распространение мыши будет иметь 40 ацентрических хромосом. Обработка твердыми частицами вызывает различные хромосомные аберрации, такие как разрыв хроматиды, ацентрический фрагмент, кольцевая хромосома, дицентрическая хромосома, двойная минута, робертсоновская транслокация и эндоредупликация. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что следует использовать только пролиферирующие клетки.

После этой процедуры для ответа на дополнительные вопросы можно использовать другие методы, такие как M-FISH и SKY. Например, присутствуют ли межхромосомные, стабильные аберрации. Не забывайте о мерах предосторожности и канцерогенах, а также о мерах предосторожности, таких как ношение перчаток, всегда следует принимать во время выполнения этой процедуры.