Пептид происхождения Метод к транспорту генов и белков через клеточные и органелл барьеры в растений

Общая цель данного метода на основе пептидов заключается в транспорте генов и белков через клеточные и органеллярные барьеры в растениях. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы путем модификации растений с помощью рационально сконструированных пептидных конъюгатов, которые доставляют различные гены и белки для обеспечения экспрессии специфических генов. Непосредственным преимуществом данной техники является использование простой процедуры трансфекции листьев растений с помощью шприца, основанной на пептидах, способных преодолевать клеточные и органеллярные границы.

Мы разработали этот простой, эффективный и новый метод трансформации растений, поскольку традиционные методы дорогостоящи, неприменимы к некоторым видам растений и не позволяют воздействовать на внутриклеточные органеллы. Джо-Энн Черч продемонстрирует процедуру вместе с Йоко Хории, техником из моей лаборатории. Подготовьте формуляцию пептидно-плазменной ДНК, как описано в текстовом протоколе.

При добавлении пептида к плазмидной ДНК образуется мутный раствор. Смесь становится прозрачной после разбавления ультрачистой водой до конечного объема, указанного в текстовом протоколе. Перенесите 800 мкл разбавленного раствора в кювету для анализа методом динамического рассеяния света.

Определите гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности образовавшихся комплексов с помощью анализатора Zetasizer. Используйте гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм при температуре 25 °C с углом регистрации обратного рассеяния 173 градуса. После измерения размера перенесите раствор в складную капиллярную кювету для измерения дзета-потенциала, используя стандартные параметры диэлектрической проницаемости, показателя преломления и вязкости воды при 25 °C.

Для наблюдения за комплексом растворов методом атомно-силовой микроскопии нанесите 10 µL на свежеотщепленную поверхность слюдяного листа и оставьте слюду высыхать на воздухе в течение ночи в закрытой пластиковой чашке Петри. Получите изображение комплексов на воздухе при 25 °C, используя кремниевый кантилевер с константой жесткости 1,3 N/m в режиме постукивания. Используйте трехнедельные растения Arabidopsis thaliana, выращенные при 16-часовом световом дне и 8-часовой темновой фазе при температуре 22 °C.

Выберите не менее трех листьев для трансфекции, чтобы обеспечить трехкратное повторение при количественном определении экспрессии генов. Наберите в пластиковый шприц без иглы объемом 1 мл 100 µL комплексного раствора для трансфекции одного листа. Затем приложите кончик шприца к абаксиальной поверхности листа.

Слегка прижмите кончик шприца к листу и медленно нажмите на поршень, создавая противодавление указательным пальцем руки в латексной перчатке с противоположной стороны. Успешная инфильтрация характеризуется распространением области, пропитанной водой, в листе. Маркируйте инфильтрированные листья для облегчения их идентификации.

Инкубируйте растение, трансфецированное пептидной плазмидной ДНК, в течение 12 часов в камере роста. Для оценки эффективности трансфекции сначала вырежьте весь трансфецированный лист. При проведении экспериментов по трансфекции с использованием репортерного вектора Renilla Luciferase количественно определите эффективность трансфекции с помощью набора для анализа Renilla Luciferase.

Сначала поместите каждый иссеченный лист в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл. Добавьте в каждую пробирку 100 мкл 1X лизирующего буфера. Аналогичным образом подготовьте лизаты контрольных нетрансфицированных листьев в трех повторностях.

Разотрите лист с помощью гомогенизационного пестика и инкубируйте полученный лизат при 25 °C в течение 6–10 часов. После инкубации центрифугируйте лизат в микроцентрифуге при 12 470 ×g в течение одной минуты. Перенесите 20 µL очищенного лизата в лунку микропланшета на 96 лунок.

Используйте оставшийся объем для количественного определения общей концентрации белка с помощью набора для BCA-анализа белка в соответствии с протоколом производителя. Затем добавьте в лунку 100 µL одного кратного субстрата для анализа Renilla Luciferase и перемешайте путем медленного пипетирования. Поместите микропланшет в многофункциональный планшетный ридер и начните измерение.

Для проведения экспериментов по трансфекции с использованием репортерного вектора с зеленым флуоресцентным белком наблюдайте флуоресценцию с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Сначала обрежьте края целого листа, чтобы облегчить удаление воздушных пузырьков. Затем извлеките поршень из шприца объемом 10 милллилитров и поместите в шприц каждый вырезанный лист или фрагмент листа.

Вставьте поршень и осторожно нажмите его до нижнего конца шприца, чтобы не раздавить лист. Наберите в шприц воду примерно до половины его объема. Направьте шприц вверх и нажмите на поршень, чтобы вытеснить воздух из шприца через наконечник.

Затем закройте отверстие шприца и медленно потяните поршень вниз, чтобы удалить воздух из листа. Повторяйте эту процедуру несколько раз, пока лист не станет полупрозрачным. После этого заклейте поверхность предметного стекла микроскопа адгезивной лентой.

С помощью лезвия вырежьте в ленте квадратную область достаточного размера, чтобы в неё поместился образец листа, и снимите квадратный кусочек ленты пинцетом, чтобы создать камеру для образца. Лента будет служить проставкой между предметным стеклом и покровным стеклом. Поместите лист в камеру абаксиальной стороной вверх и заполните оставшееся пространство камеры водой.

Закрепите лист в камере с помощью стеклянного покровного стекла и зафиксируйте края стекла адгезивной лентой. Исследуйте образец листа с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, используя объектив 40x или водный иммерсионный объектив 63x. Флуоресценцию GFP можно визуализировать при длине волны возбуждения 488 нанометров.

Оптимально приготовленная формуляция пептидно-плазмидной ДНК при соотношении пептида к ДНК 0,5 должна иметь средний диаметр примерно 290 нанометров и низкий индекс полидисперсности около 0,3, что указывает на однородное распределение частиц по размеру. Кроме того, комплексы должны обладать дзета-потенциалом примерно 30 милливольт. Здесь представлено репрезентативное изображение комплексов пептидно-плазмидной ДНК, полученное с помощью атомно-силового микроскопа.

Наблюдались гомогенные глобулярные комплексы. С использованием формуляции из пептида и плазмидной ДНК была достигнута ядерно-направленная доставка и экспрессия плазмидной ДНК в Arabidopsis thaliana с расчетным значением рениллы-люциферазы на миллиграмм примерно 100 000. Микроскопическое исследование проводили на листьях, обработанных комплексами на основе плазмидной ДНК, кодирующей репортерный белок GFP, для оценки экспрессии гена.

Изображения показали, что в клетках, трансфицированных комплексами плазмидной ДНК с нецелевым пептидом, отчетливо наблюдалась диффузная зеленая флуоресценция, соответствующая экспрессии GFP, которая локализовалась в цитозоле. После разработки этот метод открыл исследователям в области биотехнологии растений возможность доставки различных белков и нуклеиновых кислот в живые растения. После просмотра этого видео и ознакомления с текстовым протоколом вы должны четко понимать, как готовить, характеризовать и применять различные оптимизированные рецептуры для каждого типа груза, включая плазмидную ДНК, двухцепочечную ДНК или РНК, а также белки.