Пептид происхождения Метод к транспорту генов и белков через клеточные и органелл барьеры в растений

Общая цель этого метода, основанного на пептидах, заключается в транспортировке генов и белков через клеточные и органеллярные барьеры в растениях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы путем модификации растений с помощью рационально разработанных пептидных конъюгатов, которые доставляют различные гены и белки для опосредования экспрессии конкретных генов. Непосредственное преимущество этого метода заключается в том, что он использует простую процедуру трансфекции листьев растений с помощью шприца, основанную на пептидах, которые могут преодолевать клеточные и органеллярные границы.

Мы разработали этот простой, эффективный и новый метод трансформации растений, потому что традиционные методы являются дорогостоящими, неприменимыми к некоторым типам растений и не могут нацеливаться на внутриклеточные органеллы. Джо-Энн Черч будет демонстрировать эту процедуру вместе с Йоко Хории, техником из моей лаборатории. Приготовьте состав пептидной плазмы ДНК, как описано в текстовом протоколе.

При добавлении пептида в ДНК плазмы образуется мутный раствор. Смесь становится прозрачной при разбавлении сверхчистой водой до конечного объема, указанного в текстовом протоколе. Переведите 800 микролитров разведенного раствора в кювету для динамического анализа рассеяния света.

Определить гиродинамический диаметр и показатель полидисперсности образующихся комплексов с помощью зетананозайзера. С помощью гелий-неонового лазера с яркостью 633 нанометра при температуре 25 градусов Цельсия с углом обнаружения обратного рассеяния 173 градуса. После измерения размера перенесите раствор в свернутую капиллярную ячейку для измерения дзета-потенциала при стандартных параметрах диэлектрической проницаемости, показателя преломления и вязкости воды при 25 градусах Цельсия.

Чтобы наблюдать за сложным раствором с помощью атомно-силовой микроскопии, нанесите 10 микролитров на только что обнаженную поверхность листа слюды и оставьте слюду сушиться на воздухе на ночь в закрытой пластиковой чашке Петри. Получить изображение комплексов в воздухе при температуре 25 градусов Цельсия можно с помощью кремниевого кантилевера с постоянной пружины 1,3 ньютона на метр в режиме врезки. Используйте трехнедельный Arabidopsis thaliana, выращенный по циклу 16 часов в светлом, 8 часов в темноте, при температуре 22 градуса Цельсия.

Выберите по крайней мере три листа для трансплекции, которые послужат тройным числом для количественной оценки экспрессии генов. Загрузите одномиллилитровый безыгольный пластиковый шприц со 100 микролитрами комплексного раствора для переливания одного листа. Затем расположите кончик шприца на абаксиальной поверхности листа.

Слегка прижмите кончик шприца к листу и медленно нажмите на поршень шприца, оказывая противодавление указательным пальцем руки в латексной перчатке с противоположной стороны. Успешная инфильтрация может наблюдаться как распространение пропитанного водой участка в листе. Пометьте инфильтрированные листья для облегчения идентификации.

Инкубируйте пептидное плазменное растение, трансфицированное ДНК плазмы, в течение 12 часов в камере роста. Чтобы оценить эффективность трансфекции, сначала иссекаем весь трансфицированный лист. Для экспериментов по трансфекции с использованием репортерного вектора Рениллы Люциферазы определяйте эффективность трансфекции количественно с помощью набора для анализа Рениллы Люциферазы.

Сначала поместите каждый вырезанный лист в микроцентрифужную пробирку с емкостью 1,5 миллиметра. Добавьте 100 микролитров 1X Lysis Buffer на пробирку. Таким же образом готовят лизаты из нетрансфицированных контрольных листьев в трех экземплярах.

Измельчите лист с помощью пестика для гомогенизации и инкубируйте полученный лизат при температуре 25 градусов Цельсия в течение шести-10 часов. После инкубации лизат центрифугируют при 12, 470 g в микроцентрифуге в течение одной минуты. Перелейте 20 микролитров очищенного лизата в лунку в 96-луночном микропланшете.

Используйте оставшийся объем для количественного определения концентрации общего белка с помощью набора для анализа белка BCA в соответствии с протоколом производителя. Затем добавьте в лунку 100 микролитров одноразового субстрата для анализа Ренилла Люцифераза и перемешайте медленным пипетированием. Поместите микропланшет в многорежимный считыватель микропланшетов и начните измерение.

Для экспериментов по трансфекции с использованием зеленого флуоресцентного белкового репортерного вектора наблюдайте за флуоресценцией с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Сначала обрежьте края цельного листа, чтобы облегчить удаление воздушных пространств. Затем извлеките поршень из шприца на 10 миллилитров и поместите каждый иссеченный лист или часть листа в шприц.

Установите на место поршень и аккуратно надавите им на дно шприца, не раздавливая лист. Набирайте воду в шприц до тех пор, пока он не будет заполнен примерно наполовину. Направьте шприц вверх и нажмите на поршень, чтобы удалить воздух из шприца через наконечник.

Затем накройте кончик шприца крышкой и медленно потяните поршень вниз, чтобы выпустить воздух из листа. Повторите этот процесс несколько раз, пока лист не станет полупрозрачным. Далее накройте поверхность предметного стекла микроскопа скотчем.

Отрежьте квадратный участок ленты, достаточно большой, чтобы вместить образец листа, с помощью лезвия, и отклейте квадратный кусок ленты с помощью щипцов, чтобы создать камеру для образцов. Лента будет служить прокладкой между затвором и накладкой. Поместите створку в камеру абаксиальной поверхностью вверх и заполните оставшуюся площадь камеры водой.

Запечатайте створку внутри камеры стеклянной крышкой и закрепите края крышки скотчем. Исследуйте образец листа с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с объективом 40x или объективом для погружения в воду с 63-кратным увеличением. Флуоресценцию GFP можно визуализировать на длине волны возбуждения 488 нанометров.

Оптимальное приготовление пептидной плазменной формы ДНК при соотношении пептидов к ДНК 0,5 должно иметь средний диаметр приблизительно 290 нанометров и низкий индекс полидисперсии приблизительно 0,3, что указывает на равномерное распределение по размерам. Кроме того, комплексы должны проявлять дзета-потенциал примерно в 30 милливольт. Здесь показано репрезентативное изображение комплексов пептидной плазменной ДНК с помощью атомно-силового микроскопа.

Наблюдались однородные глобулярные комплексы. Используя пептидную плазменную ДНК, можно достичь ядерной адресной доставки и экспрессии плазменной ДНК у Arabidopsis thaliana с расчетным значением Renilla Luciferase per miligram приблизительно 100 000. Микроскопическое наблюдение проводили на листьях, обработанных комплексами, приготовленными с использованием плазменной ДНК, кодирующей репортер GFP для оценки экспрессии генов.

Изображения показали, что в клетках, трансфицированных нецелевыми пептидными комплексами плазменной ДНК, четко наблюдалась диффузная зеленая флуоресценция, соответствующая экспрессии GFP, и было обнаружено, что она локализуется в цитозоле. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биотехнологии растений к доставке различных грузов на основе белков и нуклеиновых кислот в живые растения. После просмотра этого видео и прочтения текстового протокола у вас должно быть хорошее понимание того, как готовить, характеризовать и применять различные оптимизированные фомуляции для каждого типа груза, которые включают плазменную ДНК, двухцепочечную ДНК или РНК и белок.