Рентгенофлуоресцентная терапия (РФА)

1. Подготовка окон на основе нитрида кремния

1. Используйте обратный пинцет, чтобы поднять окно (окна из нитрида кремния разобьются при падении).
2. Поставьте окно на предметное стекло плоской стороной вверх.
3. Приклейте небольшие кусочки скотча к боковым сторонам окна и используйте их, чтобы приклеить окна к дну чашки для культуры.
4. Простерилизовать окна в посуде для культуры УФ-излучением. Это может быть достигнуто с помощью настройки автоматической сшивки на шкафу для УФ-сшивания с последующим дальнейшим УФ-облучением под УФ-лампой в ламинарном колпаке в течение примерно 1 часа.

2. Нанесение покрытия на стерилизованные окна из нитрида кремния

1. Держите блюдо под углом примерно 45°.
2. Добавьте фильтрующий материал пипеткой к краю чашки и медленно уменьшите угол наклона, чтобы покрыть окно фильтрующим материалом.
3. Добавьте клетки в чашку для культивирования, таким же образом, и инкубируйте.
4. Время от времени наблюдайте за клетками с помощью светового микроскопа, чтобы определить, когда они готовы к использованию.

3. Фиксация и сушка клеток

1. В вытяжке с ламинарным потоком удалите фильтрующий материал с помощью легкой аспирации, наклоняя чашку, как описано выше.
2. Добавьте PBS, пипетируя к краю тарелки, держа ее под углом. Медленно уменьшите угол наклона, чтобы покрыть окно PBS.
3. Снимите PBS с помощью осторожной аспирации.
4. Пипетируя к краю чашки и, держа ее под углом, добавьте 4% PFA/PBS, pH 7, чтобы покрыть клетки. Выдержать в таком растворе 20 минут при комнатной температуре.
5. Удалите смесь PFA/PBS и утилизируйте как опасный материал.
6. Добавьте PBS, пипетируя, как описано выше.
7. Повторите шаги 3.5 и 3.6 дважды.
8. Удалите PBS с помощью легкой аспирации.
9. Добавьте 20 мМ ТРУБОК, 200 мМ сахарозы, pH 7.
10. Удалите ТРУБКИ/сахарозу с помощью легкой аспирации.
11. Повторите шаги 2.8 и 2.9 дважды.
12. Быстро промокните края и заднюю вмятину окна салфеткой Kimwipe, затем положите окно на чистую поверхность, например, на резиновый сетчатый коврик, чтобы оно высохло.

4. Рентгенофлуоресцентная визуализация клеток

1. Как только образец высохнет, проверьте наличие клеток на окнах с помощью светового микроскопа.
2. Используйте лак для ногтей, чтобы закрепить окна на алюминиевом держателе, предусмотренном балкой.
3. Вставьте алюминиевый держатель в кинематическое крепление, а затем установите его в точку фокусировки оптики в рентгеновском микроскопе и под углом около 45° к падающему рентгеновскому пучку, установленному на столиках нанопозиционирования образца.
4. Выйдите из приборной зоны рентгеновского микроскопа (обычно это домик из свинцовых стенок) и откройте заслонку. Выполните остальные действия удаленно.
5. Используя зональную пластину или зеркала Киркпатрика-Баеза, сфокусируйте монохроматический рентгеновский луч (обычно с энергией 10 кэВ) вплоть до субмикронного размера.
6. Используя этапы нанопозиционирования образца и наблюдая за положением рентгеновского луча на образце с помощью предварительно откалиброванной камеры сцинтиллятора, определите подходящую ширину и высоту растрового сканирования для захвата данных образца.
7. С помощью детектора дрейфа кремния с дисперсией по длине волны под углом 90° к падающему лучу и на расстоянии около 3 мм или менее от образца собирают тестовый спектр с временем задержки 1–2 сек.
8. Просматривая тестовый спектр, выберите подходящее время задержки для сканирования, чтобы обеспечить достаточное соотношение сигнал/шум для интересующих элементов.
9. Выберите подходящее разрешение для сканирования, которое не должно быть значительно меньше размера пятна луча на образце и не больше, чем интересующие его особенности в образце.
10. Запрограммируйте сканирование в программном обеспечении для сканирования и соберите изображение.