Идентификация внутриклеточных сигнальных событий, наведенных в жизнеспособные клетки при взаимодействии с соседними сотами Проходят апоптотической гибели клеток

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы идентифицировать индуцированные сигнальные события и жизнеспособные реагирующие клетки после их физического взаимодействия с соседними мертвыми клетками. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, патологии и физиологии, такие как влияние, которое мертвые или умирающие клетки оказывают на своих живых соседей. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он прост и недорог, а также может быть применен для изучения биологических эффектов, индуцированных в живых клетках после их взаимодействия с соседними клетками, подвергающимися апоптозу.

Демонстрировать эту технику будет Ланьфэй Фэн, техник в моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, пропустите клетки BUNPT на 100-миллиметровые вакуумные чашки для культуры газовой плазмы, обработанные тканями, вырастите их в культуральной среде А до слияния и увлажненной 5% атмосферы углекислого газа при 37 градусах Цельсия. После этого трижды промыть монослой адгезивных клеток питательной средой В. Затем вызвать апоптоз путем инкубации клеток в культуральной среде В, содержащей ставроспорин, неселективный ингибитор протеинкиназы, в течение 3 часов при 37 градусах Цельсия.

Через 3 часа соберите среду, содержащую плавающие апоптотические клетки, которые оторвались от монослоя. Затем центрифугируйте эту среду в течение десяти минут при 500-кратном G. После этого выбросьте надосадочную жидкость, трижды промойте гранулу питательной средой В, прежде чем добавить ее обратно в адгезивные клетки. После этого этапа промывки отделите оставшиеся адгезивные клетки, добавив 5 миллимолярных ЭДТА в 1X DPBS, не содержащем кальция и магния.

Соберите среду, содержащую оторвавшиеся апоптотические клетки, и поместите отделенные клетки с плавающими апоптотическими ячейками в стерильную 15-миллилитровую полистирольную центрифужную пробирку. Затем трижды промыть апоптотические клетки центрифугированием в течение десяти минут при 500 x G. Затем повторно суспендировать в десяти миллилитрах 1X кальция и магния DPBS за одну промывку. После последней промывки суспендируйте апоптотические клетки в свежей питательной среде B в концентрации 5x10^6 клеток на миллилитр, прежде чем использовать их для стимуляции ответных клеток.

В качестве альтернативы зафиксируйте промытые апоптотические клетки в 0,4 параформальдегида в 1X DPBS на 30 минут, затем трижды промывайте их культуральной средой B и суспендируйте в ней в концентрации 5x10^6 клеток на миллилитр перед использованием для стимуляции ответных клеток. После переноса клеток BUNPT на стерильные вакуумно-плазменные чашки из полистирола диаметром 100 мм, обработанные тканевой культурой, выращивают их до слияния и увлажнения атмосферы с содержанием углекислого газа 5% в разрешающих условиях. Затем монослой адгезивных клеток трижды промывают 10 мл питательной среды В за одно полоскание.

Затем отделите клетки, добавив 5 мМ ЭДТА в 1X DPBS без кальция и магния. Соберите отделенные клетки из среды, содержащей ЭДТА, и добавьте клеточную суспензию в стерильную полистирольную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Затем промывайте клетки три раза центрифугированием в течение десяти минут при 500 G и ресуспендированием в 10 мл DPBS без кальция и магния на одну промывку.

После последней промывки суспендируйте клетки в свежей питательной среде В в концентрации 5x10^6 клеток на миллилитр. После этого вызвать некроз, нагревая клетки до 70 градусов Цельсия в течение 45 минут на водяной бане, мягко вортексируя эту клеточную суспензию каждые десять минут. После индукции некроза инкубируйте клетки в течение двух часов во увлажненной атмосфере с содержанием углекислого газа 5% при температуре 37 градусов Цельсия и осторожно перебрасывайте клеточную суспензию каждые 15 минут.

В ходе этой процедуры клетки BUNPT выращивают в стерильных 100-миллиметровых чашках для культивирования тканей в разрешительных условиях, пока они не достигнут примерно 85% конфлюенции. После этого аспирируйте питательную среду А и трижды промывайте клетки 10 мл питательной среды В за одно промывание. Затем сыворотку голодают клетки в культуральной среде B в течение 18-24 часов в увлажненной атмосфере с содержанием углекислого газа 5% в неблагоприятных условиях, чтобы вызвать состояние покоя.

Пометьте отдельную чашку для культивирования тканей с конфлюентными клетками BUNPT для шести экспериментальных условий для следующей процедуры. Теперь аспирируйте питательную среду B из предварительно помеченных чашек неподвижных клеток-ответчиков BUNPT. Для приготовления 100-миллиметровых блюд в различных условиях добавьте по два мл либо питательной среды В без клеток, либо суспензию апоптотических клеток в концентрации 5X10^6 клеток на миллилитр в культуральной среде B, либо суспензию некротических клеток в дозе 5X10^6 клеток на мл в культуральной среде B. Добейтесь соотношения мертвых и отвечающих клеток один к одному, добавив к мл мертвых клеток из расчета 5X10^6 клеток на миллилитр до конфлюентная 100-миллиметровая тарелка, которая содержит 10X10^6 клеток.

Аккуратно перемешайте посуду. Затем инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с содержанием углекислого газа 5%. Через 30 минут стимулируйте клетки-ответчики либо носителем, либо 15 нМОЛЬ EGF, в соответствии с предварительной маркировкой чашки для культур.

Инкубируйте клетки в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с содержанием углекислого газа 5%. После этого промойте мертвые клетки, добавив пять миллиметров ледяного DPBS. Перемешайте посуду и отасуньте жидкость для промывки.

Повторите стирку три раза. Затем сразу же поместите тарелки ответчика на лед для дальнейшей обработки. На этом рисунке показано, что воздействие апоптотических клеток на пассивные BUNPT-рессоры в течение 30 минут сильно ингибировало базальное фосфорилирование GSK3 альфа-бета.

Чтобы предотвратить физическое взаимодействие между ответчиками BUNPT и апоптотическими клетками, ответчики BUNPT были выращены в проницаемой системе поддержки и отделены от апоптотических мишеней поликарбонатной мембраной толщиной 0,4 микрона. Предотвращение физического взаимодействия между ответчиками BUNPT и апоптотическими клетками уничтожило способность апоптотических мишеней ингибировать фосфорилирование GSK3 альфа-бета. Для оценки роли фагоцитоза использовали ингибитор цитоскелета Цитохалазин D для предотвращения фагоцитарного поглощения мертвых клеток.

Ингибирование фосфорилирования GSK3 альфа-бета в ответ на апоптотические клетки происходило в отсутствие фагоцитоза. После освоения этой методики ее можно сделать за 4-6 часов при правильном выполнении, исключив время, необходимое для гель-электрофореза и иммуноблоттинга. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что использование клеточной суспензии в отличие от растворимого лиганда в качестве стимула создает несколько неотъемлемых и в значительной степени неизбежных экспериментальных препятствий.

Используя ту же процедуру, можно изучать другие функции клетки, такие как выживание или пролиферация или рост клеток, чтобы определить функциональные последствия сигнальных событий, которые индуцируются в живых реагирующих клетках после их взаимодействия с соседними мертвыми клетками. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как идентифицировать конкретные сигнальные события, которые индуцируются в жизнеспособных ответящих клетках после их физического взаимодействия с соседними мертвыми клетками.