Высокое разрешение респирометрии для оценки митохондриальной функции в проницаемыми и неповрежденных клеток

Общая цель этой процедуры заключается в использовании респирометрии высокого разрешения для определения потребления кислорода митохондриями. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о синдромах и заболеваниях, связанных с митохондриальной дисфункцией, таких как; сепсис, различные неврологические заболевания и возрастные нарушения. Основными преимуществами данной методики являются то, что она обладает более высокой чувствительностью и возможностью проведения экспериментов по титрованию сопряженных ингибиторов субстратом с небольшим количеством биологических образцов, таких как интактные или пермеабилизированные клетки.

Демонстрировать процедуру будет Сандра Нансоз, техник из моей лаборатории. Перед началом процедуры полярографические датчики кислорода откалибруют воздухом, затем ресуспендируют клетки в дыхательном буфере до концентрации 10-6 клеток на миллилитр и заменяют дыхательную среду в одной камере оксиграфа 2,1 миллилитрами клеточной суспензии. Закройте камеру пробкой и установите магнитную мешалку в камере на 700 оборотов в минуту.

Затем записывайте клеточное дыхание в течение 5-10 минут до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал потока кислорода. Далее с помощью шприца введите два микролитра Ротенона через титановый инъекционный порт в камеру оксиграфа и запишите клеточное дыхание еще от 5 до 10 минут. Когда будет достигнут стабильный сигнал потока кислорода, введите 20 микролитров одного молярного сукцината, а затем 10 микролитров 0,5 молярного АДФ.

Затем вводят два объема по два микролитра двух миллимолярных дигитонинов и записывают клеточное дыхание в течение двух-пяти минут после каждой инъекции с последующим ступенчатым введением двух-четырех микролитров двух миллимолярных дигитонинов до тех пор, пока сигнал потока кислорода не достигнет максимального уровня, и дальнейшие инъекции дигитонина не увеличивают частоту дыхания. Для оценки целостности внешней мембраны митохондрий подготовьте камеру с оксиграфом, как показано выше, и введите два микролитра восьмимиллимольного дигитонина для проникновения в клетки. Через пять минут введите 20 микролитров одного молярного сукцината и записывайте клеточное дыхание в течение 5-10 минут до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал потока кислорода.

Затем введите 10 микролитров 0,5 молярного АДФ, чтобы стимулировать комплекс два и вызвать увеличение потребления кислорода. Когда будет достигнут стабильный сигнал потока, введите пять микролитров четырехмиллимолярного цитохрома с, а затем один микролитр четырех миллиграммов на миллилитр лигамицина. Чтобы измерить АДФ-стимулированное дыхание клеток гепатоцеллюлярной карциномы печени, подготовьте оографическую камеру, как показано выше, и введите два микролитра восьми миллимоларных дигитонинов в кислородную камеру для проникновения клеток в течение пяти минут, после чего следует инъекция 12,5 микролитров 0,8 молярного малладе и 10 микролитров двух молярных глутамата.

Когда будет достигнут стабильный поток кислорода, введите 10 микролитров 0,5 молярного АДФ для увеличения потребления кислорода, затем два микролитра 0,2 миллимолярного ротенона и 20 микролитров одного молярного сукцината. Далее вводят два микролитра пятимиллимолярного антимицина и записывают клеточное дыхание. Когда сигнал уменьшится и стабилизируется, введут 2,5 микролитра 0,8 миллимолярного эскорбата с последующим немедленным введением 2,5 микролитра 0,2 миллимоляра TMPD, регистрируя клеточное дыхание до тех пор, пока сигнал потока кислорода не усилится и не стабилизируется.

Затем введите в камеру оксиграфа 10 микролитров одного молярного азита натрия, и записывайте клеточную аспирацию до тех пор, пока сигнал потока кислорода не уменьшится и не стабилизируется. Чтобы измерить потребление кислорода интактной клеткой, подготовьте камеру для оксиграфии, как только что было показано, и введите 1 микролитр четырех миллиграммов на миллилитр алигимицина, а затем одну и три микролитра 0,2 миллимоляра FCCP. Затем титруйте FCCP с шагом от 0,1 до 0,3 микромоляра путем введения от одного до трех микролитров от 0,2 до одного миллимолярного FCCP до тех пор, пока сигнал потока кислорода не достигнет своего максимального уровня без дальнейшего увеличения, а затем начнет снижаться.

Затем введите два микролитра 0,2 миллимолярного ротенона и два микролитра пяти миллимолярного антимицина А и записывайте дыхание до тех пор, пока сигнал потока кислорода не уменьшится и не стабилизируется. В отсутствие дигитонина клеточное дыхание очень низкое, а дыхание интактных, непроникнутых клеток не стимулируется в присутствии митохондриального субстрата и АДФ. Однако при ступенчатом добавлении дигитонина клеточная плазматическая мембрана становится проникающей, и митохондриальное дыхание увеличивается до полной пермеабилизации, после чего сукцинат и АДФ проникают в клетки.

Однако целостность внешней мембраны митохондрий может быть нарушена, если используется чрезмерное количество дигтонина, что приводит к снижению сложного до зависимого состояния третьего дыхания. Цитохром с не усиливает сложное до зависимого состояния дыхание в клетках, обработанных дигитонином, что указывает на отсутствие потери цитохрома с из внешней мембраны митохондрий и на то, что целостность митохондрий сохраняется, даже несмотря на то, что цитохром с может усиливать дыхание клеток, обработанных очень высокими дозами дигитонина. Добавление экзогенных субстратов активности митохондриального комплекса после пермеаблинизации дигитонина индуцирует увеличение максимальных скоростей дыхания комплексов митохондриальной дыхательной цепи в один, два и четыре раза.

Образование сниженных дыхательных уровней может быть связано с загрязнением камер оксиграфа митохондриальными ингибиторами из предыдущего эксперимента. В присутствии алигимицина и последовательном присоединении FCCP наблюдается максимальная частота дыхания клеток без сцепления. После освоения любой из этих техник можно выполнить менее чем за час, если он выполнен правильно.

При попытке выполнить эту процедуру очень важно тщательно помнить о камерах и пробках для промывки оксиграфа после каждого эксперимента. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как измерение содержания АТФ в клетках, каждый из которых проявляется в киматической активности, уровнях митохондриального субстрата, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, связаны ли изменения частоты дыхания с недостатком митохондриальных субстратов или снижением активности цинтатов АТФ. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области бионегетики к изучению функции митохондрий в таких областях, как приобретенные и генетические митохондриальные заболевания, окислительный стресс, повреждение перфузии кожи и старение в неповрежденных или проникнутых клетках или волокнах и изолированных митохондриях.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как помочь митохондриям функционировать в пермеабилизированных и интактных клетках с помощью респирометрии высокого разрешения. Не забывайте, что работа с антимицином А, ротеноном, йозидом натрия, FCCP и арикомицином может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лабораторных халатов.