С помощью рентгеновской кристаллографии, биофизики и функциональными пробами, чтобы определить механизмы управляющих Т-клеточного рецептора распознавания рака антигенам

Общая цель этой процедуры заключается в получении растворимых лежачих Т-клеток рецептора и пептидных белков HLA достаточного качества для использования в биофизическом и структурном анализе. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области Т-клеточной иммунологии. Например, почему Т-клетки не реагируют устойчиво на рак?

Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы получаем механистические данные с чрезвычайно высоким разрешением, объясняющие, как Т-клеточные рецепторы распознают свои мишени, что приводит к Т-клеточным иммунным реакциям. Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику практически любого заболевания человека, потому что Т-клетки играют ключевую роль в большинстве иммунных реакций. Хотя этот метод может дать представление об иммунных реакциях Т-клеток, он также может быть применен к другим системам, которые контролируются взаимодействием рецепторных лигандов.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что очень трудно получить растворимые, активные белки достаточного качества для биофизических и структурных экспериментов. Чтобы начать процедуру повторного сворачивания пептида HLA до шести миллилитров гуанидинового буфера с 10 миллиметром дитиотреитола, добавьте 30 миллиграммов тел включения HLA-A2, 30 миллиграммов бета-2-М телец включения и четыре миллиграмма желаемого пептида, представляющего интерес. Выдерживайте смесь в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем разбавьте смесь одним литром буфера HLA, предварительно охлажденного до четырех градусов Цельсия, и перемешайте смесь в течение трех часов при этой температуре. Дважды диализируйте смесь против 20 литров 10 миллимолярного триса, pH 8,1, в течение 24 часов каждый. Чтобы начать процедуру повторного сворачивания TCR, к шести миллилитрам гуанидинового буфера с 10 миллимолярным дитиотреитолом добавьте по 30 мг TCR Альфа и бета-цепи IB.

Инкубируйте смесь в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и разведите смесь в одном литре предварительно охлажденного буфера TCR. Разбавленную смесь TCR перемешать и диализовать так же, как и смесь пептидов HLA. Обе диализованные смеси рефолда отфильтруйте через мембранный фильтр 0,45 микрометра.

Затем загрузите один из отфильтрованных препаратов рефолда в колонку анионообменной смолы объемом 7,9 мл 50 микрометров, предварительно уравновешенную 20 миллилитрами 10 миллимолярного триса, pH 8,1. Разбавляйте белок с помощью буферной системы с градиентом соли со скоростью пять миллилитров в минуту. Соберите доли в одном миллилитре и проанализируйте дроби с помощью SDS-Page.

Соедините фракции, содержащие повторно свернутый белок. Поместите белковую смесь в центробежный концентратор с молекулярной массой 10 килодальтон. Центрифугируйте смесь в течение 20 минут или столько, сколько требуется, при 4000 умноженных на г, чтобы концентрировать смесь до 500 микролитров.

Откажитесь от сквозного потока. Сформируйте концентрированный белковый препарат в петлю для инъекций объемом два миллилитра и введите белок в колонку эксклюзионной хроматографии объемом 24 миллилитра, предварительно уравновешенную соответствующим буфером для неуловимости. Разбавьте белок одним столбиком объемом буфера со скоростью 0,5 миллилитра в минуту.

Соберите доли в одном миллилитре, проанализируйте дроби с помощью SDS-Page и объедините фракции, содержащие интересующий белок. Приготовьте 10 последовательных разведений раствора TCR в диапазоне концентраций от 10 до 10 раз ниже KD специфического взаимодействия HLA с пептидом TCR, если оно известно. В противном случае начните с концентрации TCR 200 микромоляров.

Затем активируйте чип датчика, покрытый карбоксиметилированным декстраном, путем подачи смеси 100 миллимоляров и N-гидроксисукцинимида и 400 миллимоляров EDC один к одному на чип со скоростью потока 10 микролитров в минуту в течение 10 минут при температуре 25 градусов Цельсия. Затем загрузите 110 микролитров стрептавидина с концентрацией 200 микрограммов на миллилитр и 10 миллимолярных ацетатов с pH 4,5 во все четыре проточные ячейки, чтобы функционализировать поверхность чипа. Деактивируйте любые оставшиеся реакционноспособные группы с помощью 100 микролитров одного молярного этаноламида гидрохлорида.

Затем подайте раствор примерно одного микромолярного пептида HLA в буфере, предоставленном производителем микросхемы, по поверхности чипа со скоростью 10 микролитров в минуту до тех пор, пока количество единиц отклика не увеличится на 500-600. Насытите поверхность чипа одним миллимолярным биотином и предоставленным производителем буфером в течение 60 секунд. Затем введите 10 последовательных разведений раствора TCR со скоростью 30 микролитров в минуту при температуре 25 градусов Цельсия.

Вычислите равновесную константу связи и запустите кинетический анализ. Проведите серию экспериментов SPR таким образом, изменяя только температуру, при которой вводятся разведения TCR. Определите равновесную константу связи для каждой температуры и рассчитайте энергии Гиббса и другие термодинамические параметры.

Подставляйте энергии Гиббса в зависимости от температуры с помощью нелинейной регрессионной аппроксимации. Концентрируйте пептидный раствор HLA до 0,2 миллимоляра и кристаллизационный буфер путем центрифугирования при 3000-кратном избытке в центробежном концентраторе с молекулярной массой 10 килодальтон. Приготовьте 0,1 миллимолярный раствор один к одному TCR и пептида HLA для кокомплексной кристаллизации.

Используя кристаллизационный робот и набор для скрининга, подготовьте испытания кристаллизации с использованием метода сидячей капли в 96-луночном планшете. С 60 микролитрами кристаллизационного буфера в каждом резервуаре, и каждая капля состоит из 200 нанолитров белкового раствора и буфера. Выращивайте кристаллы при температуре 18 градусов по Цельсию.

Оценка кристаллов под микроскопом через 24 часа, 48 часов, 72 часа, а затем еженедельно. После того, как монокристаллы достаточного качества вырастут, соберите монокристаллы с помощью криоген-совместимой петли и храните кристаллы в жидком азоте. Проведите синхротронную рентгеновскую дифракцию под потоком газообразного азота при давлении 100 кельвинов, проанализируйте полученные данные и разгадайте структуры с помощью соответствующего программного обеспечения.

Рассчитайте контакты, комплементарность поверхностей и угол пересечения от решенных конструкций. С помощью этих методов молекулы TCR и пептида HLA экспрессировались и сворачивались в растворимую форму. Пептидом в молекулах пептида HLA был антиген gp100.

SPR использовали для определения аффинности связывания PMEL17 TCR с антигеном при различных температурах. Затем были использованы SPR и изотермическое калориметрическое титрование для определения термодинамических параметров белок-белкового взаимодействия. Комплекс PMEL17 TCR A2-YLE-9V был кристаллизован и оценен с помощью синхротронной рентгеновской дифракции.

Были идентифицированы петли TCR CDR и остатки пептида HLA, контактирующие с белком TCR, и изучена природа контактов. Пептидные молекулы HLA с мутировавшими формами пептида также были очищены и кристаллизованы таким образом. Исследовать структурные различия, которые могут препятствовать связыванию взаимодействия с TCR.

Было обнаружено, что мутация третьего или пятого остатка значительно изменяет положение пролина 4, что может нарушить многие контакты с TCR CDR-3 Alpha Loop. При попытке выполнить эту процедуру важно выбрать только самые чистые белки для дальнейшего анализа. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как пептидное окрашивание тетрамером HLA, с использованием растворимых белков для выделения антиген-специфических Т-клеток из крови пациента для диагностики и дальнейшего анализа.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области Т-клеточной иммунологии к изучению связывания HLA пептида TCR в мельчайших деталях, что позволило разработать новые лекарства от рака и других заболеваний человека. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить белки TCR и пептидные HLA достаточного качества для проведения биофизического и структурного анализа.