Производство репликации ретровируса Дефектные от переходных Трансфекция 293T клетки

Мы находимся в Институте исследований молекулярной онкологии при Медицинском центре Тафтса в Новой Англии. Меня зовут Кристина Леско, я постдокторант в лаборатории доктора Рика Вана. Наша лаборатория занимается изучением хронического миелолейкоза человека (CML) и заболеваний, подобных CML.

Мы моделируем это заболевание человека на мышах, используя ретровирусный вектор для введения человеческого онкогена. Таким образом, первым шагом для внедрения этого человеческого онкогена в клетки мыши является создание самого вируса. Следующим этапом будет непосредственное титрование вируса.

Перед вами планшет с моим стоком клеток 2 9 3 T. Мне необходимо удалить среду, промыв клетки PBS. Клетки 2 9 3 T являются адгезивными, однако они прикрепляются не очень сильно, поэтому все манипуляции должны выполняться крайне осторожно. После промывки мы заменим PBS на трипсин.

Для того чтобы отделить клетки от планшета, необходимо поместить его обратно в инкубатор примерно на три минуты. Спустя две-три минуты клетки перейдут в состояние суспензии. Затем мы добавим еще несколько мл обычной среды.

Это нейтрализует трипсин. На данном этапе мы перемешиваем суспензию вверх-вниз, чтобы убедиться, что все клетки равномерно распределены, затем переносим ее в пробирку объемом 50 мл и подсчитываем количество клеток с использованием трипан синего и гемоцитометра вручную. Сейчас я выполняю разведение согласно расчетам, после чего высею по 3×10⁶ клеток на каждую планшетную лунку.

В 4 ml среды мы проверяем, что клетки равномерно распределены по поверхности, после чего возвращаем планшеты в инкубатор на 16–18 часов, обычно до следующего утра. Таким образом, сейчас прошло 48 часов после заражения вирусом GFP. Хлорохин используется для увеличения поглощения ДНК, которую мы будем вводить в клетки.

Мы осторожно удалили среду из лунок с клетками, которые к этому моменту прикрепились к поверхности планшета, аккуратно придерживая его за край. Теперь мы поместим планшеты обратно в инкубатор примерно на один час. Тем временем мы подготовим смесь ДНК для нанесения на клетки: одну группу, экспрессирующую ген устойчивости к неомицину, и другую, экспрессирующую GFP. Для контроля всего процесса трансфекции я использую ДНК Xl.

Наконец, мы добавляем хлорид кальция. Использование хлорида кальция значительно повышает эффективность трансфекции. Прошел один час; мы берем планшеты со средой, содержащей хлорохин, и добавляем раствор для трансфекции.

Последний этап заключается в добавлении 1 ml стерильного 2x HBS. При добавлении раствора 2x HBS необходимо одновременно вортексировать пробирку, вводя раствор медленно, по капле. Это позволяет избежать выпадения осадка. Затем следует немедленно распределить по 1 ml раствора в соответствующие лунки планшета, также добавляя жидкость по каплям.

На данном этапе клетки 2 9 3 T достаточно сенсибилизированы из-за использования среды с хлорохином. Необходимо, чтобы вся поверхность была покрыта, и перемещать планшеты как можно меньше; пометьте планшет названием внесенной конструкции и повторите процедуру для следующей конструкции.

На данном этапе поместите планшеты в инкубатор на период от 7 до 11 часов. Минимум на 7, но не более 11 часов, так как клетки становятся очень чувствительными из-за хлорохина и после этого времени потребуется заменить среду. В данный момент прошло около 30 часов после трансфекции.

На данном этапе мы проводим последнюю замену среды, так как клетки 2 9 3 C3 T достигли конфлюэнтности. Нам снова необходимо действовать очень осторожно при добавлении новой среды по краю планшета. Я использую шприц объемом 10 ml с иглой.

Я заменю иглу фильтром, поэтому на данном этапе я тщательно перемешиваю среду; теперь, когда вирус собран, его можно хранить при температуре -80 °C до использования. Первым делом необходимо титровать вирус. При создании вируса есть несколько критических этапов, первый из которых — достижение правильной концентрации клеток 293T.

Мы высеваем их в количестве 10⁶ клеток на планшет, так как через 18 часов они достигнут примерно 80% конфлюэнтности. Это оставляет им время для дальнейшего роста, поэтому через 24 часа после трансфекции они будут 100% конфлюэнтны. Было показано, что это весьма важно для получения высокого титра вируса.

Следующим этапом является использование хлорохина; применение хлорохина фактически сенсибилизирует клетки 2 9 3, поэтому все замены среды необходимо проводить очень осторожно, чтобы весь пласт клеток 2 9 3 T не отслоился от планшета. Наконец, ДНК, используемая для создания вируса, должна быть максимально чистой. Мы используем ДНК, очищенную методом CsCl-градиентного центрифугирования.

После получения вируса мы храним его при температуре -80 °C. Обычно мы определяем титр вируса дважды, так как при каждой разморозке титр снижается. Поэтому мы предпочитаем заморозить полученный вирус и определить его титр непосредственно перед началом основных экспериментов.

В зависимости от используемых вирусов мы можем использовать либо экспрессию GFP для отслеживания фактически инфицированных клеток, либо неомициновую резистентность. Кроме того, крайне важно определить титр вируса перед использованием, чтобы обеспечить сопоставимость результатов между отдельными экспериментами или разными мутантами.