Drosophila Подготовка и Продольная Визуализация сердца Функция In Vivo Использование оптической когерентной микроскопии (ОКМ)

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации функции сердца дрозофилы в продольном направлении in vivo с использованием метода оптической когерентной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области структурного и функционального развития сердца дрозофилы, предоставляя такие показатели, как изменения диаметра сердца, частоты сердечных сокращений и периода сердечной деятельности во время метаморфоза дрозофилы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что оптическая когерентная микроскопия способна неинвазивно визуализировать сердца мелких животных с высоким пространственным и временным разрешением.

Этот метод может помочь выявить механизмы сердечных заболеваний человека и их связь с сердечным развитием из-за генетического сходства, которое существует между дрозофилой и позвоночными. Этот метод также может быть применен к другим системам, таким как оптогенетическая стимуляция для изучения или лечения ослабленной функции кардиостимулятора на животных моделях. При выращивании мух для этого эксперимента дайте размножающимся родительским мухам спариться и отложите яйца в свежий флакон в течение восьми часов.

Таким образом, кладка отложенных яиц разовьется в мух аналогичного возраста. Чтобы установить личинку для ОКМ-визуализации, сначала подготовьте чистую сторону с помощью куска двустороннего скотча. Вытолкните все захваченные пузырьки воздуха под лентой.

Далее с помощью мягкой щетки удалите из флакона личинку нужного размера. Поместите личинку на чистую ткань. Удалите прилипшую к нему пищу с помощью увлажненной щетки и дайте ей высохнуть.

Теперь под широкопольным микроскопом подтвердите стадию развития личинки. Затем расположите личинку спинной стороной вверх для крепления. Затем опустите липкое предметное стекло на личинку и с помощью умеренного давления закрепите его на ленте.

Поместите установленную личинку на регулируемый столик системы OCM по y-образному поперечному направлению спинной стороной вверх. Небольшое отверстие в стадии предотвращает контакт личинки с плоскостью сцены. Широкий просвет сердечной трубки находится от сегментов А5 до А8. Используя изображения на компьютере в режиме реального времени, найдите заднюю область сердечной трубки и переместите стадию вперед, пока не станет виден сегмент А7.

Теперь задайте параметры получения изображения. Используйте 100 А-сканов на B-скан и 100 B-сканов. Затем установите напряжение сканера так, чтобы оно покрывало около 0,28 миллиметра в x-поперечном направлении, и установите его на 0 вольт в y-поперечном направлении.

Затем заблокируйте путь луча образца темной тканью и нажмите кнопку «Пуск» в программном обеспечении, чтобы получить данные о фоновом шуме для вычитания фона. Для получения изображений в поперечном M-режиме настройте параметры до 128 A-сканов на B-скан и используйте 4 096 B-сканов. Затем отрегулируйте напряжение так, чтобы оно покрывало 0,28 миллиметра в направлении x и 0 вольт в направлении y, как и раньше.

Затем получите изображения в поперечном M-режиме сегмента A7 сердечной трубки мухи. В процессе сохранения данных заблокируйте луч изображения темной тканью, чтобы свести к минимуму воздействие света на образец образца. Сделайте снимки сердца пять раз, чтобы получить надежное измерение функции сердца.

Чтобы получить трехмерные изображения, используйте 400 А-сканов на В-скан, 800 В-сканов и используйте напряжение 1,7 миллиметра на X-поперечном и около 4 миллиметров на y-поперечном. Затем переместите столик микроскопа, чтобы наблюдать за мухой целиком, и отрегулируйте фокус, чтобы увидеть четкие изображения. Чтобы удалить личинку, с помощью влажной мягкой щетки переложите ее в новую пробирку со свежим кормом для продолжения развития и продольного изучения.

Широкий просвет сердечной трубки сохраняется на сегментах от А5 до А8 на стадии куколки PD1. В PD1 попытайтесь получить изображение сегмента A7, как это делается с личинками стадии L2 и L3. Стадия куколки PD1 идентифицируется по белому пупарию.

Это временное окно идеально подходит для выполнения оптической визуализации ранней куколки, поскольку высокая прозрачность приводит к более высокому проникновению света для OCM-визуализации. Очистите куколку щеткой, если к телу прилипла пища. С помощью влажной щетки закрепите куколку на небольшом предметном стекле и держите спинной стороной вверх.

Предметное стекло должно помещаться в мухоморную трубку, чтобы сохранить развитие животного в собственной камере. Высушите лишнюю воду из куколки, а затем поместите ее на сцену так, чтобы куколка была обращена вверх, и приступайте к изображению сегмента А7, как это было сделано с личинкой. После визуализации перенесите предметное стекло с куколкой в пробирку для непрерывного культивирования.

После стадии PD1, начиная с PD2, между сегментами А1 и А4 начинает развиваться коническая камера. Поскольку куколка становится все более непрозрачной, глубина проникновения системы визуализации уменьшается. При PD2 оболочка куколки приобретает желтоватый оттенок, а тело становится менее прозрачным, чем у PD1.

У PD3 окрас куколки еще немного темнее, чем у стадии PD2. К стадии PD4 внутри оболочки можно наблюдать черные полосы. Некоторые PD4 разовьются во взрослых особей, а другие войдут в стадию PD5.

На стадии PD5 черные полосы еще более заметны. Возьмите куколку PD2 с помощью пинцета и закрепите ее на предметном стекле. В системе OCM найдите передний конец сердечной трубки, а затем переместитесь примерно на 50 микрон к заднему, чтобы найти сегмент А1 сердечной трубки.

Обратите внимание, что на стадии PD2 коническая камера сердца очень маленькая и может еще не биться. Продолжайте работу с изображением, как описано выше. Повторите ту же процедуру для визуализации дрозофилы на стадиях PD3, PD4 и PD5.

Для начала переложите взрослую муху в пустой флакон, который имеет объем около 45 миллилитров. Затем опустите ватный аппликатор в обезболивающий раствор и поместите палочку в флакон ватным наконечником чуть ниже ватной пробки. Подождите три минуты.

Взрослая муха будет находиться под наркозом в течение двух с половиной или трех с половиной минут, в зависимости от ее размера. Теперь подготовьте предметное стекло с кусочком двустороннего скотча. Затем с помощью мягкой щетки переместите обезболенную муху на предметное стекло тыльной стороной вверх.

Под широкоугольным микроскопом отделите крылья с помощью пинцета и приклейте их к ленте, обнажив таким образом сердечную область для визуализации. Теперь используйте ранее описанную технику визуализации для получения изображения сегмента А1 сердца и пожертвуйте мухой в конце эксперимента. Продольная визуализация сердца проводилась с использованием штаммовых мух с одной копией драйвера 24B-GAL4.

На личиночных стадиях сердечная трубка начинается в задней брюшной области А8 с более широким просветом и заканчивается в переднем дорсальном сегменте А1 с более узким диаметром. В конце PD2 в сегменте от А1 до А4 начала развиваться коническая камера. Частота сердечных сокращений у мух была количественно определена по поперечным изображениям OCM в М-режиме.

Любопытно, что во время стадии куколки сердце время от времени переставало биться. В целом, сердцебиение значительно замедлилось от личиночной стадии до стадии куколки, а затем значительно увеличилось от куколки до взрослой особи. С тех пор этот метод дал исследователям в области кардиологии развития новый инструмент для изучения влияния различных генов на развитие сердца в моделях дрозофилы.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно тщательно отслеживать развитие дрозофилы, чтобы создавать изображения на каждой стадии развития.