Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом

Общая цель этой процедуры заключается в извлечении РНК высокой чистоты из семян растений. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии зерновых, такие как понимание профилей генов, содержащих исходные транскрипты в семенах. Основное преимущество этой методики заключается в том, что исследователи могут получать высокоочищенную РНК с небольшой модификацией метода, основанного на спиновой колонке.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что большое количество масел, белков, углеводов и полифенолов в переднем сите затрудняет выделение высокоочищенной РНК; Демонстрировать процедуру будет Кадзуми Хикино, техник из нашей лаборатории. Чтобы начать эксперимент, добавьте один процент веса на объем молекулярно-биологического класса PVP в буфер для лизиса клеток для экстракции РНК и энергично перебивайте смесь. Инкубируйте ПВП в течение 20 минут при температуре 25 градусов Цельсия, чтобы полностью растворить его.

После 20 минут инкубации осторожно перемешайте буфер, перевернув трубку вверх дном, чтобы предотвратить образование пузырьков. Соберите плоды с растений Arabidopsis thaliana и поместите их в две 1,5-миллиметровые полипропиленовые трубки на льду, затем поместите плоды на алюминиевые пластины при температуре четыре градуса Цельсия и изолируйте семена из плодов под стереомикроскопом. Далее поместите примерно 200 изолированных семян в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 миллилитров, которые ранее хранились в алюминиевой решетке на льду, и сразу же поместите пробирки в жидкий азот.

Извлеките трубки из жидкого азота и верните их на алюминиевую решетку на льду. Добавьте 100 микролитров однопроцентного буфера PVP в каждую пробирку и центрифугируйте пробирки в течение одной минуты при 1000-кратной перегрузке, при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования гомогенизируйте образец пестиком из нержавеющей стали с помощью моторной кофемолки в течение 60 секунд, удерживая пробирку в алюминиевой решетке на льду; Затем добавьте 550 микролитров 100% буфера PVP и аккуратно переверните пробирку вверх дном, чтобы перемешать и инкубировать пробирку.

После инкубации раствор центрифугируют, затем переносят 550 микролитров надосадочной жидкости в новую 1,5-миллиметровую полипропиленовую пробирку и центрифугируют надосадочную жидкость. Переложите 450 микролитров надосадочной жидкости в новую полипропиленовую трубку диаметром 1,5 миллиметра. Используйте надосадочную жидкость в качестве лизата клеток для извлечения РНК с помощью коммерчески доступного набора.

Подготовьте алюминиевую решетку на льду и разморозьте всю смесь РНК, слегка постукивая, затем поместите пробирку на решетку. Измерьте концентрацию РНК с помощью микрообъемного спектрофотометра. Затем разбавьте общую РНК в воде, не содержащей РНКазы.

Разморозьте общее количество РНК и буферных наборов из коммерческого набора, храните ферменты из набора на льду после легкого постукивания. Подготовьте стерилизованные безнуклеазные полипропиленовые пробирки объемом 0,2 миллилитров для последующего анализа. На льду соедините пять микролитров общей РНК, один микролитр или 50 микромоляров олиго-праймера DT и один микролитр, или 50 микромоляров случайной шестимерки в 0,2-миллилитровой полипропиленовой трубке.

Выдержите смесь в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия, затем поместите трубку на лед. Отрегулируйте концентрацию плазмид для матриц ДНК в соответствии со стандартными кривыми. Далее растворы CDNA разбавляют в соотношении один к 100 с дистиллированной водой, затем добавляют в мастер-смесь два микролитра разбавленных растворов CDNA и предварительно приготовленных плазмид по стандартным кривым из набора для количественной ПЦР в реальном времени.

Наконец, настройте ПЦР в реальном времени и вставьте образцы. Общая РНК была выделена примерно из 1000 семян с использованием различных концентраций буфера для лизиса клеток, PVP. Количество и чистота выделенных РНК показывают, что 1,0% PVP является наиболее эффективной концентрацией для выделения большого количества очищенной РНК из семян.

Концентрации, соотношения А260 и А280, а также А260 и А230 РНК, выделенных из 200 семян, показали, что этот метод лучше всего подходит для выделения высокоочищенных РНК через 8 и 12 дней после цветения, или семян DAF. Несмотря на то, что количество морщинистых и сахарозависимых транскриптов относительно невелико в развивающихся семенах, с помощью ПЦР в реальном времени удалось обнаружить изменения экспрессии между семенами на разных стадиях развития; Этот метод подходит и для других масличных семян, как показано в этой таблице. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии растений к изучению профилей экспрессии генов в высокой концентрации хранящихся резервов, таких как семена и плоды.