Метод для измерения Метаболизм в отсортированном субпопуляции сложных сообществ клеток с использованием стабильных изотопов Tracing

Общая цель этого метода заключается в использовании изотопного отслеживания для измерения метаболизма отсортированных популяций сложных клеточных сообществ. Таким образом, с помощью этого метода мы можем изучать метаболические различия между субпопуляциями сложных клеточных сообществ, а также метаболическое сотрудничество между этими субпопуляциями. Основное преимущество этого метода заключается в том, что, сочетая отслеживание изотопов с сортировкой клеток, мы можем получить более надежные данные о метаболизме, а также проверить, насколько надежен метод.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как он сочетает в себе различные методы, а способ обработки клеток и продолжительность процедуры могут повлиять на клеточный метаболизм. Для извлечения метаболитов из чашки сначала культивируют клетки в шестилуночном планшете в культуральной среде, меченной стабильными изотопами, содержащей диализованные добавки. Когда клетки достигнут 75% конфлюенции, промойте лунки два раза 500 микролитрами холодного HBSS, содержащего равномерно меченую глюкозу.

Затем добавьте в каждую лунку по 600 микролитров 100% сухого льда, предварительно охлажденного метанолом, и переложите пластину к сухому льду. С помощью скребка для клеток отделите клетки, а затем осторожно переложите экстракты из каждой лунки в отдельные микроцентрифужные пробирки. Храните клетки при температуре минус 80 градусов Цельсия до масс-спектрометрического анализа.

Для экстракции метаболитов отсортированных клеток культивируют клетки в 100-миллиметровой чашке в меченой питательной среде с диализованными добавками, чтобы они достигли 75% конфлюенции к дню сортировки. Для импульсного мечения клеток, отсортированных по клеточному циклу, культивируют клетки в немеченой среде, содержащей диализованные добавки, до тех пор, пока они не достигнут 75% конфлюенции. Затем импульсную маркировку клеток в течение двух часов, заменив среду свежей меченой питательной средой.

Промойте чашку теплым HBSS, содержащим равномерно меченую глюкозу, и отделите клетки 1,5 миллилитрами трипсина ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия. Через четыре минуты деактивируйте трипсин тремя миллилитрами ледяного HBSS, содержащего меченую глюкозу и диализированные добавки, и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров для центрифугирования. Ресуспендируйте гранулу в HBSS, содержащем меченую глюкозу, диализованные добавки и ЭДТА в концентрации от 10 до 6 клеток на миллилитр, и отфильтруйте клетки через 40-микронный фильтр для получения суспензии для одной клетки.

Переложите клетки в пятимиллилитровую пробирку и отсортируйте их на проточном цитометре. Для извлечения метаболитов из фиктивных отсортированных клеток отсортируйте мусор и отсортируйте только синглеты. Для извлечения метаболитов из клеток клеточного цикла отсортируйте обломки и дублеты, а также отсортируйте клетки на G1 и SG2M на основе флуоресценции гемининового зонда.

В конце сортировки соберите ячейки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 50 микролитрах ледяной дистиллированной воды для получения однородной гранулы. Затем быстро извлеките метаболиты, добавив 540 микролитров сухого льда охлажденного метанола. Храните образец при температуре минус 80 градусов Цельсия до анализа LCMS.

Извлечение метаболитов из отсортированных клеток должно быть хорошо спланировано заранее, а экспериментальная работа должна быть завершена как можно быстрее, чтобы свести к минимуму метаболические изменения. Для анализа извлеченных метаболитов сначала выберите ряд метаболитов с соответствующими доступными стандартами, которые демонстрируют пики хорошего качества образца. Затем проверьте качество пиков, стараясь не включать в них ложные изотопы.

Рассчитайте массовый изотоп из наших фракций для образцов, меченных изотопами, разделив пиковую площадь каждого массового изотопа из нашей фракции на общую пиковую площадь всех массовых изотопов из наших фракций. Затем рассчитайте меченые доли углерода для обогащения углерода-13 по формуле обогащения углерода. Наконец, рассчитайте меченые азотные доли для обогащения азотом-15 с помощью формулы обогащения азотом.

В этом репрезентативном эксперименте 66 метаболитов, выбранных из анализа данных, присутствовали в фиктивных отсортированных клетках, 60 из которых, по-видимому, были помечены изотопом аналогичной массы из наших распределений между экстрактами чашки и фиктивными отсортированными клетками. Например, массовый изотоп из нашего распределения глутамата аналогичен между чашкой и макетом отсортированных экстрактов, что указывает на то, что массовый изотоп глутамата из нашего распределения также надежен в отсортированных клеточных популяциях. Анализ клеток HOLA, отсортированных по стадиям клеточного цикла G0, G1 или SG2M с использованием гемининового зонда FUCCI, выявил маркировку цитидина в обеих популяциях с более высоким обогащением на стадии SG2M, что согласуется с повышенным синтезом нуклеотидов de novo во время S-фазы.

В этом эксперименте массовый изотоп из нашего распределения продемонстрировал одну и ту же картину в обеих фракциях, отсортированных в клеточном цикле, что позволяет предположить, что используется один и тот же путь синтеза, но он более активен на стадии SG2M, демонстрируя, что метаболические различия легко обнаруживаются с помощью этого метода, даже между близкородственными субпопуляциями. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как извлекать метаболиты из отсортированных фракций, и понимать предостережения. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о быстрой работе с клетками во время сортировки и экстракции метаболитов, так как способ и продолжительность обработки клеток могут повлиять на их метаболизм.

После освоения этой техники ее можно выполнить за пять часов. Эта процедура может быть применена к другим типам клеток. Например, субпопуляции иммунных клеток в крови или различные типы клеток в опухоли с помощью различных зондов, антител или методов окрашивания для сортировки.