Лигандом Нано-кластер Массивы в поддерживаемому липидный бислой

Общая цель этого метода заключается в изготовлении массива белковых нанокластеров в поддерживаемом липидном бислое, который совместим с методами микроскопии чувствительных поверхностей для приложений клеточной биологии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биофизики, в частности, на то, как нанокластеризация лигандов влияет на активацию и адгезию Т-клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он легко воспроизводится в стандартной биофизической лаборатории и совместим с передовыми методами поверхностно-чувствительной микроскопии, такими как TIRF и RICM.

Хотя этот метод предназначен для того, чтобы дать представление об иммунологии, он может быть применен к другим типам клеток с потенциальными применениями в клеточной биологии, онкологии и тканевой инженерии. Чтобы начать эту процедуру, очистите стекла крышки предметных стекол и наблюдательных камер, как указано в текстовом протоколе. Затем капля капли нанесите 70 микролитров суспензии 2% кремнеземных шариков на предметное стекло, удерживаемое под углом 15 градусов.

Переворачивайте стекло на 90 градусов каждые 15 секунд в течение одной минуты, пока суспензия не высохнет. Очень важно создать плотно упакованный монослой гранул и не допустить образования многослойностей и масляных кластеров. Вот почему концентрация и объем раствора гранул, а также гидрофильность предметного стекла должны быть оптимизированы.

После того, как жидкость испарится, поместите предметное стекло внутрь радиочастотного магнатронного распылительного устройства на вращающийся стол, расположенный на расстоянии 105 миллиметров от мишени из алюминия и кремния. После этого с помощью турбомолекулярного насоса необходимо снизить давление в камере осаждения до 2,6 раза в 10 раз до отрицательной четверти Паскалей. Введите чистую атмосферу аргона с потоком 10 стандартных кубических сантиметров в минуту и давлением 0,8 Паскаля.

Далее включите радиочастотный генератор питания. После того как плазма стабилизируется, распыляйте в течение двух минут, держа затвор закрытым, чтобы удалить возможные загрязнения с поверхности мишени. Откройте затвор и дайте распылению продолжаться в течение 60 минут, чтобы слой алюминия толщиной 200 нанометров нанес на затвор.

Затем обрежьте струю аргоном. Закройте задвижку, чтобы изолировать турбомолекулярный насос от камеры осаждения. После этого проветрите камеру чистым азотом до достижения давления окружающей среды.

Извлеките затвор с алюминиевым покрытием из патронника. Погрузите восстановленную горку в ультрачистую воду комнатной температуры и ультраультразвуком на 50 Вт и 50 Гц на 30 секунд. Далее положите 0,5 миллитера APTES на дно десикатора.

Поместите предметное стекло на керамическую сетку. Поместите сетку в эксикатор. Подсоедините эксикатор к мембранному насосу.

Затем запустите насос на максимальной мощности в течение 30 минут, чтобы создать низкий вакуум. Закройте клапан эксикатора и выключите насос. Нагрейте до 50 градусов Цельсия в течение часа.

После этого откройте эксикатор и соберите предметное стекло. Поместите собранную горку на опору из ПТФЭ. Внесите 2 миллилитра по 25 микрограмм на миллилитр биотина, растворенного в PBS.

Дайте горке отдохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем прополощите 10 раз PBS. Инкубируйте предметное стекло в растворе гидроксида натрия и ПБС при комнатной температуре в течение ночи.

После этого промойте предметное стекло 10 раз ультрачистой водой. После очистки кормушки Ленгмюра поместите лотки из ПТФЭ в корпус из ПТФЭ кормушки. Затем наполните его ультрачистой водой.

Установите измеренное давление равным нулю миллиньютонов на метр. С помощью газонепроницаемого металлостеклянного шприца нанесите на поверхность воды 30 микролитров 1 миллиграмм на миллиметр DOPC и раствор хлороформа. Закройте барьер из ПТФЭ до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое давление в 27 миллиньютонов на метр для сжатия липидного монослоя.

Далее с помощью моторизованного зажима опустите подготовленное предметное стекло в корпус из ПТФЭ. Удерживайте ползунок в зажиме перпендикулярно границе раздела воздух-вода. Поднимайте слайд через интерфейс со скоростью 15 миллиметров в минуту, сохраняя при этом постоянное давление 27 миллиньютонов на метр.

Затем поместите предметное стекло горизонтально на поверхность воды над поддоном из ПТФЭ. Далее с помощью металлического пинцета протолкните предметное стекло вниз в лоток из ПТФЭ, погрузив его в сверхчистую воду. С помощью пинцета перенесите лоток из ПТФЭ, содержащий предметное стекло, в кристаллизатор, наполненный сверхчистой водой.

Перенесите предметное стекло с покрытием под воду в наблюдательную камеру. После этого закройте камеру, следя за тем, чтобы внутрь попал примерно 1 миллилитр воды. Еще одним деликатным этапом является сборка камеры для образцов под водой.

При этом следует категорически избегать контакта с воздухом отсаженных бислоев, поэтому для этого используйте большой объем воды и следите за тем, чтобы весь процесс сборки мог происходить под водой. Извлеките собранную камеру из воды, убедитесь, что камера водонепроницаема и не имеет протечек. Добавьте 500 микролитров PBS, затем удалите 500 микролитров жидкости из камеры.

Повторите этот процесс 10 раз, чтобы полностью заменить один миллилитр сверхчистой воды в камере на PBS. Далее вводят в камеру наблюдения 100 мкг на миллилитр бычьего сывороточного белка. Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут.

После этого промойте бислой, вынув и добавив 500 микролитров из камеры, 10 раз. Затем функционализируйте с помощью лигандов, депонируйте клетки и наблюдайте за протеолипидным нанопаттерном и текучестью SLB, как описано в текстовом протоколе. В этом протоколе маска с шариками используется для создания маски из вторичного металла путем контролируемого осаждения алюминия.

Затем маску из бусин снимают, оставляя слой алюминия с отверстиями. Затем органоаминосилин, называемый APTES, осаждается в паровой фазе, после чего BSA-биотин осаждается в водной фазе. Затем алюминий удаляют, обнажая нанометрические белковые пятна.

Наконец, межточечное пространство заполняется поддерживаемым липидным бислоем. Затем делаются эпифлуоресцентные изображения наноточек и поддерживаемого липидного бислоя. Составное изображение демонстрирует идеальную комплементарность с липидным бислоем, нанесенным исключительно вокруг белковых точек, но не на них.

На эпифлуоресцентном изображении только что нанесенного липидного бислоя белковые точки выглядят как темные пятна в ярком море липидов. Однако после непрерывного фотообесцвечивания в течение 50 секунд на изображении виден ореол внутри области, ограниченной полевой диафрагмой, что указывает на подвижность липидов. Анализ профиля средней интенсивности вдоль края диафрагмы поля и затухание этой интенсивности с течением времени в процессе отбеливания показывает, что константа диффузии составляет пять микрометров в квадрате в секунду.

Эту методику можно сделать за два дня, если она выполнена правильно. Важно поддерживать очень чистые условия во время осаждения алюминия и тщательно калибровать кривую осаждения. После выполнения этой процедуры узорчатый слайд может быть дополнительно функционализирован.

Например, путем добавления еще одной биомолекулы в бислой. Мы используем его для имитации антигена растительноядных клеток, чтобы изучить активацию Т-клеток. Так что после своего развития эта методика должна заинтересовать разнообразную аудиторию.

Например, тканевые инженеры могут захотеть использовать его в качестве каркаса для выращивания искусственных тканей, а онкологи могут использовать его в качестве платформы для постановки фундаментальных вопросов о добавлении раковых клеток. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить область белковых нанокластеров в поддерживаемом липидном бислое, что совместимо с передовой техникой микроскопии. Хотя мы используем это для изучения Т-клеток, мы считаем, что этот субстрат может стать платформой выбора для изучения взаимодействия любого вида клеток с контролируемой протеолипидной мембраной.