Декстран повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человеческие клетки первичной

Общая цель данного протокола заключается в разработке технологий, позволяющих успешно осуществить трансдукцию генов в первичных натуральных киллерах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунотерапии, такие как влияние генетической модификации на эффекторные лимфоциты, например, на натуральные киллеры или NK-клетки. Основным преимуществом данной методики является эффективная экспрессия целевого гена в первичных NK-клетках мыши или человека.

После подготовки и титрования лентивирусных векторов согласно текстовому протоколу очистите первичные NK-клетки мыши, пропуская суспензии одноядерных клеток селезенки через нейлоново-шерстяные колонки для удаления адгезивных популяций, состоящих из B-клеток и макрофагов. Для культивирования неадгезивной популяции, содержащей NK-клетки, используйте интерлейкин-2 в концентрации 1 000 units/ml в полной среде RPMI1640. На четвертый день культивирования замените среду, используя 20 ml полной среды RPMI1640 и 1 000 units/ml IL-2, чтобы удалить неадгезивные T- и NKT-клетки.

На седьмой день с помощью проточной цитометрии и специфических маркеров MK проверьте чистоту NK-клеток мыши, используя препараты с популяцией, содержащей более 95% CD3-отрицательных и NK1.1-положительных клеток. Для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МНКПК) осторожно наслоите 35 мл разведенных вдвое клеток поверх 15 мл градиента плотности в конической пробирке объемом 50 мл. Центрифугируйте градиент в роторе с качающимися стаканами при 400 ×g и 20 °C в течение 30 минут без торможения.

После очистки первичных NK-клеток человека согласно текстовому протоколу определите чистоту клеток, добавив антитела anti-CD3 в концентрации 2 µg/mL и антитела anti-CD56 в концентрации 2 µg/mL. Инкубируйте клетки при температуре 4 °C в течение 20 минут. Промойте клетки дважды с использованием PBS.

Затем проанализируйте клетки методом проточной цитометрии. Популяция NK-клеток будет положительной по маркеру CD56 на поверхности клеток и отрицательной по маркеру CD3. Суспендируйте первичные NK-клетки мыши или человека в лунках 24-луночного планшета в концентрации 0,5 × 10⁵ на мл среды с супернатантом лентивируса GFP при MOI, равном 5, 10 и 20.

Затем в присутствии полибрена, протаминсульфата или декстрана центрифугируйте планшеты при 1 000 ×g в течение 60 минут. После этого, не сливая супернатант, культивируйте клетки в инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5,2% CO2 в течение ночи.

После промывки клеток 10 миллилитрами PBS используйте два миллилитра среды RPMI1640 с IL-2 для ресуспендирования клеток. За день до сбора клеток покройте 96-луночные полистирольные планшеты с высокой адсорбционной способностью к белкам моноклональными антителами к MKG2D в концентрации 2.5 микрограмма на миллилитр и инкубируйте планшеты при комнатной температуре или в холодильнике в течение ночи.

На следующий день промойте каждую лунку трижды, используя по 100 µL PBS. Соберите трансдуцированные NK-клетки, предварительно осторожно постучав по планшетам, затем внесите по 100 µL клеток в каждую лунку 96-луночных планшетов. Через 16–18 часов после активации соберите супернатанты с помощью многоканального дозатора.

Затем, используя рекомбинантный цитокин из набора для ИФА, постройте стандартную кривую и определите количественное содержание цитокинов, таких как Интерферон Гамма, в супернатанте. Чтобы проверить жизнеспособность NK-клеток, через четыре дня после трансдукции дважды промойте клетки 10 миллилитрами холодного PBS. Затем соберите клетки и окрасьте их с помощью XM5 7-аминоактиномицина D.

Используйте проточную цитометрию для определения процента некротических клеток среди трансформированных NK-клеток и проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом. На этом рисунке показано, что NK-клетки человека, инкубированные с рекомбинантным IL-2 и затем трансдуцированные GFP Lentivirus, достигли более высокой эффективности трансдукции и повышения вирусного титра при добавлении декстрана в культуру по сравнению с добавлением полибрена или протаминсульфата. Как видно здесь, аналогичные результаты были продемонстрированы на NK-клетках мыши, где декстран повысил эффективность лентивирусных векторов по сравнению с полибреном или протаминсульфатом.

В данном эксперименте цитотоксическая способность трансдуцированных первичных NK-клеток была изучена с помощью анализа высвобождения хромочастиц (CR-release assay) с использованием клеток K562 и YAC-1 в качестве клеток-мишеней. Трансдукция NK-клеток декстраном не оказывает отрицательного влияния на киллинг-потенциал трансформированных NK-клеток по сравнению с нетрансдуцированными NK-клетками. В данной работе трансдуцированные первичные NK-клетки человека совместно культивировались с K562 в течение 24 часов, после чего собирали супернатанты для измерения уровня интерферона гамма.

Результаты показывают, что декстран не влияет на способность трансдуцированных NK-клеток вырабатывать цитокины. Кроме того, независимая валидация показала, что NK-клетки, обработанные декстраном и активированные иммобилизованными на планшете моноклональными антителами anti-NKG2DA10, по-прежнему способны вырабатывать цитокин интерферон гамма. При выполнении этой процедуры важно не забыть центрифугировать трансдуцированные клетки.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как трансфекция, для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, о способах улучшения доставки генов. Разработка этой методики открыла исследователям в области иммунологии путь к изучению манипуляций с генами в NK-клетках. После просмотра этого видео у вас должно сформироваться четкое понимание процесса трансдукции NK-клеток.