Надежный Пневмония Модель в иммунокомпетентных Грызуны для оценки антибактериальную эффективность против S. Пневмококк, H. гриппа, K. Пневмококк, P. палочки или A. baumannii

Общей целью этой нехирургической процедуры внутрибронхиальной инфекции является установление устойчивой бактериальной пневмонии у иммунокомпетентных грызунов. Этот метод повышает ценность для открытия и разработки антибактериальных препаратов, позволяя оценить эффективность потенциальных методов лечения в иммунокомпетентной модели тяжелой пневмонии. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он создает устойчивую и воспроизводимую легочную инфекцию со многими изолятами, включая те, которые обычно требуют нейтропении у животных, или изоляты, которые не вызывают жизнеспособную инфекцию другими методами.

Как правило, люди, плохо знакомые с этой процедурой, будут испытывать трудности. Правильная интубация — это слепая процедура, которая требует обучения правильному ощущению интубации трахеи, а не пищевода. Правильная интубация отличается для каждого ученого.

Точный угол наклона канюли может быть не для всех одинаковым. Нащупывание гребней трахеи является ключевым. Демонстрировать эту технику будет Синди Майнингер, ученый из нашей лаборатории.

Для начала приготовьте солевые бактериальные суспензии из ночных бульонных культур, как указано в текстовом протоколе, или из агаровых планшетов, как показано здесь. Собирайте урожай за ночь с агаровых пластин, используя стерильную петлю для соскребания колоний с поверхности. Заготовленный материал переложите в пять миллилитров стерильного физиологического раствора до получения мутной непрозрачной суспензии и аккуратно переведите культуру в вихрь до однородности.

Затем последовательно разводите и тарелкой по аликвоте из каждого разведения в соответствии с текстовым протоколом. После подготовки агара и сборки необходимых инструментов для процесса заражения, согласно текстовому протоколу, аликвотируйте девять миллилитров агара в стерильную трубку и затем поместите трубку на водяную баню до тех пор, пока агар не уравновесится примерно до 42 градусов Цельсия. Добавьте в тюбик агара один миллилитр приготовленной ранее солевой бактериальной суспензии.

Затем переверните трубку несколько раз, чтобы перемешать и вернуть ее в воду. Положите чистый одноразовый коврик на рабочую поверхность рядом с водяной баней. Чтобы подготовить рабочую поверхность и устройство для интубации, сначала простерилизуйте металлическую канюлю и полиэтиленовую трубку в соответствии с текстовым протоколом, а затем перенесите их в стеклянной пробирке для хранения на рабочую поверхность.

Затем снимите колпачок с пробирки для хранения и сдвиньте конец ручки канюли к открытому концу трубки. С помощью стерильных щипцов извлеките одну длину полиэтиленовой трубки из стакана и вставьте ее через внутреннюю часть стерильной металлической канюли, убедившись, что она свободно движется. Поставьте направляющую отметку в заранее определенном месте с помощью несмываемой ручки.

Затем установите стерильную одноразовую иглу 25 калибра на свободный конец полиэтиленовой трубки, вставив иглу на несколько миллиметров внутрь трубки. Затем с помощью стерильного физиологического раствора наполните свежий одноразовый шприц объемом в один миллилитр. Присоедините шприц к игле, установленной на полиэтиленовой трубке, и промойте весь объем физиологического раствора через трубку.

Выбросьте использованный шприц в контейнер для острых предметов. Затем наполните новый стерильный одноразовый одномиллилитровый шприц инокулюмом на основе агара из водяной бани. Снова прикрепите иглу 25 калибра и трубку и промывайте агар через трубку, нажимая на поршень до тех пор, пока трубка полностью не заполнится агаром.

После обезболивания крысы согласно текстовому протоколу поместите животное в лежачем положении на одноразовый коврик головой вправо, а хвостом влево. Далее вставьте свободный конец металлической канюли в рот животного. Поверните канюлю так, чтобы свободный конец был наклонен вверх и аккуратно продвигайте ее в трахею, осторожно обходя гортанные структуры легким скручивающим движением.

Подтвердите введение в трахею, в отличие от пищевода, осторожно слегка сдвинув канюлю вперед и назад несколько раз, используя указательный палец левой руки для пальпации колец трахеи. Чтобы обеспечить интубацию в трахею, а не в пищевод, слегка двигайте канюлю вперед-назад и нащупывайте гребни. Если канюля плавно скользит вниз по горлу и гребни не прощупываются, извлеките устройство и повторите попытку.

Когда канюля достигнет разветвления, где трахея разделяется на левый и правый бронхи, сделайте легкое скручивающее движение в сторону левой стороны животного, чтобы убедиться, что канюля вставлена в левый бронх. Распространенной ошибкой является недостаточное введение инокуляции в легкие, что может блокировать дыхательные пути и препятствовать дыханию. Когда канюля повернута под нужным углом, она должна легко скользить в левый бронх и плавно продвигаться на соответствующую глубину.

Продвигайте металлическую канюлю до конца на полпути к трем четвертям вниз по левому легкому, используя ранее установленную направляющую метку, чтобы подтвердить, что достигнута соответствующая глубина. Установив металлическую канюлю, переместите полиэтиленовую трубку на несколько миллиметров, используя ранее нанесенную направляющую метку на трубку, чтобы убедиться, что она продвинута ровно настолько, чтобы выйти из конца металлической канюли и не проколоть легкое. Когда обе канюли на месте, с помощью прилагаемого шприца закапывают 100 микролитров агаровой суспензии глубоко в большую долю левого легкого.

Извлеките несколько миллиметров трубки и аккуратно снимите неповрежденное устройство для интубации. Поместите его обратно в стеклянную трубку для хранения и переместите животное в новую клетку, чтобы оно восстановилось. Подготовьте рабочую поверхность и канюлю так, как только что было продемонстрировано для крыс, используя оборудование соответствующего размера для мышей.

Используйте стерильный одноразовый шприц объемом 1 миллилитр и стерильную иглу 25 калибра, чтобы наполнить стеклянный шприц для микроинъекций стерильным физиологическим раствором. Затем промойте физиологический раствор через собранное устройство. Затем используйте новый стерильный одноразовый одномиллилитровый шприц и стерильную иглу 25 калибра, чтобы наполнить микроинъекционный шприц инокулятом агара.

Затем соберите устройство и промойте агар через трубку до тех пор, пока трубка полностью не заполнится агаром. После обезболивания мыши в соответствии с текстовым протоколом расположите животное в той же ориентации, что и для крысы, и используйте постоянное, но мягкое давление для интубации трахеи таким же образом, как и в случае с крысой. Избегайте применения силы, так как эта техника более деликатна у мышей.

Убедитесь, что канюля вставлена в трахею, нащупав кольца трахеи. Слегка поверните и продвинуте канюлю в левый бронх, вводя глубоко в легкое, используя ранее размещенные направляющие метки. Установив металлическую канюлю, продвинуте полиэтиленовую трубку на несколько миллиметров и закапайте 20 микролитров агаровой суспензии.

Здесь показан репрезентативный пример колоний, растущих на агаровой пластине после серийного разведения и тройного осаждения образца гомогената легких. Как показано на этом графике с S. pneumoniae, увеличение бактериальной нагрузки на несколько log base ten КОЕ по сравнению с исходным контролем обычно наблюдается в инфицированных легких для большинства бактериальных изолятов, даже через 96 часов после заражения, и вариабельность между животными низкая. В этом эксперименте два соединения были оценены против чувствительных к хинолонам или устойчивых к хинолонам изолятов S.pneumoniae, чтобы проиллюстрировать, что эта модель легочной инфекции может быть использована при оптимизации ряда химических веществ свинца для поддержки взаимосвязей структурной активности.

Каждый символ представляет КОЕ, определенный из легких одной крысы. Здесь представлены модели E max, созданные с использованием данных об эффективности дифференцирования доз у иммунокомпетентных мышей, инфицированных в легких изолятами S.pneumoniae или H.influenzae, для определения фармакокинетических, фармакодинамических мишеней для нового ингибитора полипептиддеформилазы. Кружки представляют среднюю бактериальную нагрузку от четырех до пяти мышей в группе, получавших различные дозы соединения.

Разомкнутые круги представляют собой свободную область под кривой, а закрашенные круги представляют площадь под кривой времени концентрации над минимальной ингибирующей концентрацией. После освоения этой техники она может быть выполнена примерно за 30 секунд на животное, при этом на один шприц с инокулятом агара прививается до пяти или шести животных. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как выполнять этот нехирургический метод внутрибронхиальной инфекции и уметь использовать его для установления легочных инфекций с множеством различных бактериальных изолятов.

энергетический инструмент