Генерация интеграции свободных индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови с помощью эписомальные векторы

Общая цель этой процедуры заключается в получении iPS-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови взрослого человека с использованием неинтегрирующихся эписомальных векторов. Этот протокол может помочь ученым в области стволовых клеток, которые хотят получить iPS-клетки для мониторинга заболеваний, скрининга лекарств и регулярной радиотерапии. Наш протокол перепрограммирования очень прост, но очень эффективен.

После этой процедуры можно легко освоить технику перепрограммирования клеток крови. Качество плазмы не менее важно для успешного перепрограммирования. Загрязняющие вещества могут снижать эффективность перепрограммирования, поэтому мы рекомендуем использовать наборы Endofree для очистки эписомальных плазмид.

iPS-клетки более хрупкие, чем другие клетки. Подготовка клеток к более чем одной клетке во время пассажа гена может вызвать массовую гибель клеток, особенно на ранних пассажах. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте все необходимые питательные среды в соответствии с прилагаемой рукописью.

Затем смешайте 10 мл свежего образца PB и десять мл буфера PBS в пробирке объемом 50 мл и хорошо перемешайте. Перед использованием доведите PBS до комнатной температуры или 37 градусов Цельсия. Далее добавьте на дно пробирки 10 мл фиколла.

Этот процесс следует проводить медленно, чтобы слой ficoll не смешивался с PB. Центрифугируйте смесь при давлении 400 х г в течение 30 минут с низким ускорением и замедлением. После центрифугирования ТНК PB находятся в белом слое, расположенном между плазмой PB и фиколлом. Медленно отсасывайте 10 мл PB плазмы, не нарушая слой бафф-фиколла.

Затем аккуратно соберите белый слой в новую пробирку объемом 50 мл. Общий объем собранных клеток из белого слоя должен составлять около трех-шести мл. После этого добавьте PBS, чтобы довести общий объем до 30 мл и хорошо перемешайте.

Затем центрифугируйте образец при давлении 400 х г в течение десяти минут. Через десять минут удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 20 мл питательной среды. Хорошо перемешайте и центрифугируйте образец при давлении 400 x g в течение пяти минут, чтобы удалить большую часть тромбоцитов.

Впоследствии удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном-двух мл IMDM. Клетки могут быть использованы для немедленного культивирования или заморожены для последующего использования. Для криоконсервации добавьте равное количество криоконсервирующего материала.

Превратите клетки в криовиалы и сразу же перенесите их в морозильную камеру при температуре 80 градусов Цельсия. В этой процедуре приготовьте пять мл среды IMDM в пробирке объемом 15 мл. Быстро разморозьте замороженные PB MNC на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, прежде чем переложить их в пробирку со средой IMDM.

Центрифугируйте образец при давлении 400 x g в течение пяти-десяти минут. После этого удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в эритроидной среде. Затем подсчитывают клетки под микроскопом с помощью гемоцитометра.

Впоследствии, культивируя PB MNC в нетканевой культуре, обрабатывали шестилуночный планшет двумя мл среды на лунку при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% содержанием углекислого газа. В третий и пятый день добавьте по одному мл свежей эритроидной среды непосредственно в каждую лунку, не меняя среду. На шестой день соберите PB MNC для нуклеофекции.

За сутки до нуклеофекции предварительно обработайте культуру тканей шестилуночным слоем 0,1% желатина при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Разморозьте инактивированные фидерные клетки MEF на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия и немедленно перенесите их в пробирку объемом 15 мл, содержащую пять мл среды MEF. Далее центрифугируйте их при 400 х г в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость.

Затем извлеките желатин из шестилуночной пластины и повторно суспендируйте клеточную гранулу в среде MEF. После этого высадите инактивированные клетки MEF в два мл среды MEF в каждой лунке предварительно обработанного желатином шестилуночного планшета и культивируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% увлажненным углекислым газом. В день нуклеофекции аспирируйте среду MEF и замените ее одним мл эритроидной среды.

Затем предварительно уравновесьте культуральную тарелку в течение 10-30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в увлажнённом инкубаторе с 5% углекислым газом. Добавьте два микрограмма PEV OCT4 к Sox2, один микрограмм PEV MYC, один микрограмм PEV KLF4 и 0,5 микрограмма PEV Bcl-XL в стерильную пробирку объемом 1,5 мл. Нагрейте трубку до 50 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы предотвратить загрязнение, а затем охладите ее до комнатной температуры.

После этого добавьте в образец 57 микролитров нуклеофекционного буфера и 13 микролитров буфера для добавок. Соберите урожай два раза по десять-шестую культивируемые PBMNC в пробирку объемом пять мл центрифугированием при 200 x g в течение семи минут. После этого удалите надосадочную жидкость и добавьте в клеточную гранулу смесь плазмиды и буфера нуклеофекции.

Затем хорошо перемешайте, щелкнув пальцем по трубке. Затем перенесите ДНК в клеточной суспензии на кювету, предусмотренную набором, и закройте кювету. Выберите программу U-008 на нуклеофекционном устройстве.

Впоследствии вставьте кювету в держатель и нажмите OK. После этого выньте кювету из держателя. Добавьте 0,5-1 мл предварительно подогретой эритроидной среды в каждую кювету и немедленно перенесите клетки в предварительно уравновешенную пластину MEF. Для некоторых образцов вы можете получить тысячи колоний из одного миля крови.

Если вы хотите выбрать одну колонию для дальнейшего культивирования, вам может потребоваться засеять одну дополнительную лунку всего с 1 миллионом клеток. Непосредственно перед помещением камеры гипоксии в инкубатор осторожно покачайте камеру несколько раз, чтобы создать равномерное распределение клеток в культуральных лунках. Затем перенесите планшет в камеру гипоксии.

Промойте камеру газовой смесью в течение одной-двух минут со скоростью 20 литров в минуту. После этого запечатайте камеру и культивируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия. На второй день после нуклеофекции добавьте по два мл среды iPSC непосредственно в каждую лунку.

На четвертый день после нуклеофекции удалите три мл среды и добавьте два мл свежей среды iPSC. На этом этапе большая часть живых клеток уже прикреплена к питающему слою. После шестого дня после нуклеофекции меняйте среду каждые два дня, оставляя 500 микролитров отработанной среды и добавляя два мл свежей среды E8 с добавлением 0,25 миллимоларов бутирата натрия до 14-18 дней.

Здесь показана схема протокола перепрограммирования клеток периферической крови. На этом изображении показан АП, стоящий в чаше, а на этом изображена типичная ESC-подобная колония iPSC на 14-й день после нуклеофекции PB MNC. Вот репрезентативные диаграммы FACS iPSC в пятом проходе, экспрессирующие TRA-1-60 или SSEA4.

Вот репрезентативные конфокальные изображения колоний iPSC, экспрессирующих NANOG и OCT4. На приведенных здесь изображениях показано H&E окрашивание терратомы, состоящей из всех трех слоев зародыша. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить свободные от интеграции iPS-клетки из мононуклеарных клеток периферической крови человека.

После освоения можно создать большое количество iPS-ячеек за три недели, так что время работы составит менее трех часов. Мы разработали простую эписомальную векторную систему для эффективного перепрограммирования клеток крови. Мы считаем, что эта доступная по цене система может быть легко внедрена, в частности, в небольших лабораториях с ограниченными ресурсами.

Не забывайте, что работа с человеческой кровью и плазмой может быть опасной, поэтому необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лабораторных халатов во время выполнения этой процедуры.