Мониторинг экзоцитоз реактивности и распространения в Vitro условиях ишемии как

Следующий протокол предназначен для демонстрации выделения первичных астроцитов из мозга детенышей крыс для выполнения кислородного голодания глюкозы или OGD. Воздействие очищенных астроцитов на окружающую среду, лишенную кислорода глюкозы, является модулем, который позволяет нам проверить реакцию на некоторые условия, обнаруженные при ишемических инсультах. Методические изменения, после воздействия кислорода можно наблюдать и измерять недостаточность глюкозы с помощью селективных астроцитарных маркеров, таких как GFAP.

Таким образом, эти изолированные клетки, подвергшиеся воздействию ишемических условий, могут быть использованы для тестирования новых путей, активированных в условиях гипоксии, и других препаратов, защищающих от ишемического инсульта. В этой части протокола астроциты будут выделены из коры детенышей крыс. Целью данной процедуры является получение первичной культуры астроцитарных клеток для проведения экспериментов по кислородному голоданию глюкозы.

Материалы для этой процедуры следующие, Автоклавируйте все материалы перед использованием их в этой процедуре. И подвергайте вытяжку воздействию ультрафиолетовых лучей не менее 20 минут перед началом протокола. Чтобы начать эту процедуру, пипетируйте от трех до пяти миллилитров полной среды DME в каждой пластине.

Он будет разделен следующим образом: по одному для каждого мозга мыши, по два для всей коры головного мозга и три для всей коры головного мозга без мозговых оболочек. Обезглавьте щенка после дезинфекции 70% этанолом. Сделайте надрез, начиная от затылка по направлению к носу.

Удалите череп изогнутым щипцом и аккуратно соскребите мозжечок, обнажив кору. Удалите обнаженные мозги с помощью пинцета и поместите мозг в первую чашку Петри со средой. Повторите эти действия для всех остальных щенков.

Разделите полушария головного мозга, аккуратно разделив вдоль средней линии трещину острым концом микрорассекающих щипцов. Очистите кору, удалив белое вещество и гиппокамп с помощью пинцета сжимающими движениями, оставив их позади. Перенесите кортикальную кожуру в чашку Петри с надписью номер два.

Повторите процедуру для всех мозгов, объединив все рассеченные коры головного мозга в чашке Петри. Аккуратно встряхните чашку, чтобы равномерно распределить среду между всеми кортикальными отложениями. С помощью диссекционного микроскопа определите мозговые оболочки, выстилающие отслоившуюся кору.

Мозговые оболочки представляют собой очень тонкий прозрачный слой, который можно идентифицировать по маленьким красным капиллярам, окружающим ткань. Внимательно осмотрите и удалите мозговые оболочки, выстилающие кору головного мозга, и аккуратно снимите их с отдельных корковых долей с помощью тонкого пинцета с обеих сторон каждой коры. Поместите чистую кору головного мозга в новую чашку Петри с надписью номер три.

Для диссоциации тканей методом желудка или блендера высыпьте чистую очищенную кору головного мозга и среду из чашки Петри в стерильный пакет для блендера. И добавьте достаточно среды, чтобы довести общий объем пакетика до пяти миллилитров. Поместите мешок в желудок 80, оставив примерно два сантиметра мешка видимыми над закрытой дверцей.

Диссоциация клеток в этом приборе производится через 2,5 минуты с высокой скоростью. В качестве альтернативы можно провести диссоциацию тканей, закрыв стерильный пакет и осторожно постучав по ткани стаканом в капюшоне до тех пор, пока частицы ткани не превратятся в тонкую суспензию. Обязательно используйте ткань между мешком и стаканом, чтобы избежать трения и поломки сумки.

Залейте ячейку суспензии в центр рукава с помощью сетки No 60. Вылейте отфильтрованные ячейки в середину сетки под номером 100, позволив ее фильтровать под действием силы тяжести. Перелейте отфильтрованную клеточную суспензию в коническую 15-миллилитровую трубку.

Центральный фуг суспензии элемента при 200-кратном перегрузке в центральном фуге предпочтительно с помощью роутера с качающимся ведром в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и выбросьте в стакан. Добавьте в палитру ячеек полноценные свежие среды.

С помощью серологической пипетки ресуспендируют и диссоциируют палитру клеток максимум в пяти миллилитрах среды. Добавьте нужное количество клеточной суспензии в колбу и дополните средой. Добавьте ресуспензированную палитру в колбу с медиумом.

Равномерно распределите ячейки по всей колбе и поместите их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Не забывайте менять носители каждые три дня. Приведенная ниже методика предназначена для лишения клеток кислорода и глюкозы в контролируемой среде.

Целью данной модели является изучение реакции астроцитов при ишемоподобном инсульте. Материалы, используемые для этой процедуры: Продуйте среду, не содержащую глюкозы, путем введения серологической пипетки, подключенной к газовой системе. Пузырьковый раствор с газовой смесью в течение 10 минут со скоростью от 10 до 15 литров в минуту.

По истечении 10 минут отрегулируйте pH среды OGD до 7,4. Отфильтруйте продувочную среду, не содержащую глюкозы, с помощью 50-миллилитровой трубчатой фильтрующей системы. Для каждого эксперимента важно всегда готовить свежую среду ОГД.

Это обеспечит очистку среды от кислорода. Удалите астроцитарную среду и промойте клеточной PBS два раза, чтобы удалить глюкозу из клеток. Добавьте в лунки среду ОГД.

Поместите многолуночную форму с открытой крышкой внутрь камеры гипоксии. Подсоедините газовую смесь к входному клапану и оставьте выпускной клапан открытым. Промывайте камеру газовой смесью со скоростью от 10 до 15 литров в минуту в течение пяти-семи минут.

Остановите подачу газа и сначала закройте хомут на выпускном клапане. Затем закройте зажим на трубке входного газового клапана. Поместите гипоксическую камеру в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия на желаемое время в ОГД.

По истечении времени инкубации аспирируйте среду OGD и осторожно добавьте полный DMEM в клетки для нормоксического состояния. Возвращают клетки в культуральный инкубатор на нулевые 24 и 48 часов нормоксических условий. Этот протокол описывает выделение астроцитов из коры головного мозга новорожденных крыс.

После проверки чистоты первичных культур были проведены эксперименты с ОГД. В этой ишемической модели депривация глюкозы и кислорода вызывала более фологическое изменение, которое контролировалось с помощью иммунофлуоресценции с использованием астроцитарных маркеров, таких как GFAP, или маркеров пролиферации, таких как PCNA. Одним из преимуществ этой модели является то, что она позволяет изучать реакцию конкретного типа клеток.

Хотя ограничением в этой методике является отсутствие межклеточного взаимодействия из-за выделения астроцитов. Одним из возможных способов преодоления этого ограничения является воздействие на астроциты кондиционных сред из других типов клеток или совместной культуры. Таким образом, метод кислородного голодания глюкозы в изолированной клеточной системе позволяет нам непосредственно проверять эффекты различных нейронных защитных или нейротоксических молекул.

Кроме того, это действенный инструмент для изучения биологии астроцитов. Наконец, эта модель закладывает прочную основу для изучения разрабатываемых лекарств в экспериментальных условиях с использованием моделей in vivo.