Легионелл везикул наружной мембраны: Выделение и анализ их провоспалительного потенциала на макрофагах

Общей целью данного исследования является очистка наружных мембранных везикул или OMV от Legionella pneumophila стандартизированным способом и анализ их влияния на репликацию бактерий в макрофагах человека и мышей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования везикул внешней мембраны. Например, стандартизированная процедура приготовления OMV может помочь изучить их влияние на взаимодействие хозяина и патогена.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечит стандартизированный протокол для изучения влияния OMV Legionella pneumophila на макрофаги человека или мыши, и это улучшит наше понимание патогенности Legionella pneumophila. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы задумались о возможном провоспалительном потенциале OMV и о том, как это может повлиять на течение инфекции, поскольку OMV высвобождаются легионеллой как внутри клетки-хозяина, так и внеклеточно. Процедуру продемонстрируют Керстин Хоффманн, техник из моей лаборатории, и Аналина Янг, научный сотрудник с докторской степенью.

Для начала, работая в стерильных условиях, распределите ядро штамма L.pneumophila B на агаровых планшетах BCYE и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех дней. Используйте L.pneumophila из предкультурального планшета для инокуляции 10 миллилитров среды YEB с OD600 0,3 и инкубируйте бактерии при 37 градусах Цельсия во вращающемся вибростенде в течение шести часов. Проверьте чистоту жидкой культуры, разложив 100 микролитров суспензии на кровяной агаровой пластине.

Инкубируйте планшет с кровяным агаром в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте оставшуюся жидкую культуру в 90 миллилитров свежей среды YEB и инкубируйте культуру на вращающемся вибростенде до тех пор, пока ее внешний диаметр не достигнет 600 от 3,0 до 3,5. Центрифугируйте жидкую культуру при 4 000 г в течение 20 минут, чтобы гранулировать бактерии.

Затем переложите надосадочную жидкость в свежие центрифужные пробирки. Выбросьте бактериальные гранулы и снова центрифугируйте образцы, прежде чем повторить этап центрифугирования еще раз. Далее фильтром стерилизуют оставшуюся надосадочную жидкость дважды.

Затем переложите несодержательную надосадочную жидкость в ультрацентрифужные пробирки и вращайте образцы при температуре 100 000 г при четырех градусах Цельсия в течение трех часов. Сцедите надосадочную жидкость и выбросьте ее. Затем используйте стерильный PBS для ресуспендирования гранул OMV и их объединения.

Повторите этап ультрацентрифугирования, чтобы удалить загрязняющие белки и свободный ЛПС. Теперь выбросьте надосадочную жидкость и высушите ультрацентрифужную пробирку стерильным ватным тампоном. Суспендируйте гранулу OMV с 500 микролитрами стерильного PBS.

Затем нанесите по 20 микролитров на кровяные агаровые и БЦКЕ агаровые пластины, чтобы исключить бактериальное загрязнение подготовленного пузырька. Инкубируйте планшет с кровяным агаром на ночь, а планшет с агаром BCYE в течение трех дней. Используйте анализ BCYE в соответствии с инструкциями производителя для количественного определения количества белка для полученного препарата OMV.

После дифференцировки клеток THP-1 в макрофаги в соответствии с текстовым протоколом используйте 500 микролитров свежей среды для замены среды для дифференцировки и инкубируйте клетки еще 24 часа при 37 градусах Цельсия. Для обработки THP-1 или мышиных BMDM-клеток с помощью OMV размораживают ранее приготовленные OMV и добавляют соответствующее количество в клетки. Инкубируйте макрофаги с OMV при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 20 часов, чтобы заразить предварительно обработанные или необработанные клетки THP-1 ядром B штамма L.pneumophila дикого типа или мышиные клетки BMDM с лишенным жгутиков мутантом этого штамма, не меняя среду из клеток.

Добавьте бактерии при MOI 0,5, что составляет один умножить на 10, к пятому L.pneumophila на лунку. Инкубируйте культуры в течение 24 и 48 часов соответственно. Чтобы лизировать клетки, добавьте сапонин в конечной концентрации 0,1% и инкубируйте клетки в течение пяти минут.

Затем ресуспендировать лизированные макрофаги методом пипетирования и перенести суспензию в реакционный сосуд. Используйте стерильный PBS для приготовления серийных разведений суспензии L.pneumophila. Затем нанесите 50 микролитров требуемых разведений на агаровые пластины BCYE и инкубируйте пластины в течение трех дней.

Визуально подсчитывайте образовавшиеся колонии на глаз и проводите расчеты по текстовому протоколу. В этом эксперименте, изучающем провоспалительный потенциал L.pneumophila OMV, PMA-дифференцированные клетки THP-1 реагируют на это увеличением секреции IL-8 и IL-6 в зависимости от времени и дозы. В данной работе было проанализировано влияние различных толл-подобных рецепторов на распознавание L.pneumophila OMV у мышиных МПК с различным генетическим фоном с использованием анализа CXCL-1 ELISA.

Мышиные BMDM от мышей дикого типа секретировали CXCL-1 после стимуляции OMV, в то время как мышиные BMDM от TLR2/4 с двойным нокаутом выделяли значительно меньше. Для изучения влияния OMV L.pneumophila на репликацию бактерий в макрофагах THP-1 клетки предварительно инкубировали с OMV в течение 20 часов, а затем дополнительно инфицировали L.pneumophila. Предварительная стимуляция макрофагов, полученных из THP-1, сначала снижает дозу репликации бактерий после 24 часов заражения, в то время как это приводит к удвоению количества КОЕ в более поздний момент времени.

Как показано в этом эксперименте, предварительная стимуляция мышиных МПДМ с помощью OMV приводит к десятикратному увеличению количества КОЕ в мышиных МПДМ у диких животных, в то время как нокаут TLR2 и макрофаги TRIF/MyD88 не показывают такого увеличения репликации L.pneumophila после преинкубации OMV. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости работы в стерильных условиях и проверять очищенные OMV на наличие бактерий. В противном случае последующий анализ не дает окончательных результатов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ отслеживания наночастиц, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какой мутант легионеллы производит больше или меньше OMV, или исследовать влияние различных стрессовых условий на секрецию OMV. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области исследований OMV для изучения влияния OMV на взаимодействие хозяина и патогена in vitro, а затем in vivo. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как очищать ОМВ и с чего начать анализ их влияния на последующее заражение макрофагов.

Этот протокол может быть применен к различным грамотрицательным бактериям и их соответствующим клеткам-хозяевам после адаптации времени инкубации и роста. Не забывайте, что работа с Legionella pneumophila может быть чрезвычайно заразной для человека, поэтому работа всегда должна проводиться под стерильным столом во время работы с легионеллой и выполнения этой процедуры.