Выделение мыши Эндометриальный эпителиальных и стромальных клеток для

Общими целями данной процедуры являются выделение и культивирование первичных эндометриальных стромальных и эпителиальных клеток мыши для их последующего совместного культивирования с целью изучения децидуализации in vitro. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области репродуктивной медицины, такие как: каковы механизмы паракринной сигнализации между эпителиальными и стромальными клетками в ходе таких важных процессов, как децидуализация и инвазия трофобласта, и как регулируется этот сигнальный путь. Эти методы могут быть использованы для изучения процесса децидуализации в системе совместного культивирования эпителиальных и стромальных клеток.

С помощью этой системы можно оценить, способны ли сигнальные молекулы, секретируемые одной из двух клеток, влиять на этот процесс. Перед забором матки проведите исследование мазка из влагалища, чтобы определить фазу цикла у животных. Это необходимо для отбора только тех мышей, которые находятся в фазе эструса.

Как характеризуется наличием эпителиальных клеток роговицы в вагинальном мазке. Затем с помощью пинцета и ножниц вскройте брюшную полость животного в первой фазе эструса и отодвиньте кишечник в сторону, чтобы визуализировать оба рога матки. Захватив один рог на самом дистальном конце, под фаллопиевой трубой, отделите ткань матки от фаллопиевой трубы, используя анатомический пинцет и пинцет Dumont номер пять для удаления жировой и соединительной тканей.

Затем удалите рог на дистальном конце, выше тела матки. После удаления рогов матки поместите их в чашку Петри диаметром 35 мм с тремя миллилитрами HBSS. Когда все рога матки будут собраны, перенесите чашку под стереомикроскоп и с помощью пинцета удалите остатки жировой и соединительной тканей.

Затем с помощью пинцетов Dumont №5, анатомического пинцета и маленьких пружинных ножниц рассеките рога матки продольно, чтобы открыть их просвет, и промойте ткани в новой чашке Петри со свежим HBSS. Теперь перенесите все рога в пробирку объемом 15 мл, содержащую панкреатин и трипсин. Инкубируйте ткани в горизонтальном положении в течение 60 минут при 4 °C и 50 rpm на орбитальном шейкере.

По истечении часа перенесите пробирку на стол для горизонтальной инкубации в течение 45 минут без встряхивания, после чего проведите горизонтальную инкубацию без встряхивания в течение 15 минут в водяной бане при 37 °C. По окончании инкубации в водяной бане осторожно слейте супернатант и перенесите матки в чашку Петри, содержащую холодную среду для эпителиальных клеток эндометрия мыши, на пять минут для инактивации трипсина. Затем перенесите ткани в пробирку объемом 15 мл, содержащую 3 мл холодного HBSS, и перемешайте ткани на вортексе в течение 10 секунд для высвобождения эпителиальных пластов.

Затем промойте матки в новой чашке Петри, содержащей 3 мл свежего HBSS, и соберите еще две суспензии эпителиальных пластов в две новые пробирки объемом 15 мл, как было показано ранее. После третьего перемешивания тканей на вортексе перенесите матки в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую смесь для переваривания стромальных клеток эндометрия мыши, для инкубации в течение 30 минут при 37 °C и 200 об/мин. Извлеките эпителиальные пласты, аккуратно пропустив три клеточные суспензии через нейлоновую сетку с размером ячеек 100 мкм для удаления тканевого детрита, с последующим центрифугированием полученной суспензии клеток.

Ресуспендируйте осадок в 12 миллилитрах среды для эпителиальных клеток эндометрия мыши, тщательно перемешивая, затем дайте раствору отстояться в течение пяти минут, чтобы оставшиеся стромальные клетки эндометрия мыши отделились под действием силы тяжести. По завершении седиментации с помощью пятимиллилитровой пипетки осторожно удалите верхние два миллилитра супернатанта и центрифугируйте собранные клетки. Затем снова суспендируйте осадок эпителиальных клеток мыши в эпителиальной среде, аккуратно дозируя пипеткой.

Затем высейте клетки на покровные стекла, покрытые коллагеном, с плотностью, соответствующей запланированному последующему анализу. После изоляции эпителиальных клеток перейдите к работе со стромальными клетками: достаньте из инкубатора пробирку с маточниками мышей, находящимися в процессе переваривания стромальных клеток. После 30-минутной инкубации, как было показано, осторожно встряхните пробирку вручную в течение 10 секунд и перенесите маточники в чашку Петри, содержащую 3 mL HBSS при 4 °C.

Тщательно промойте ткани, затем добавьте три миллилитра среды для стромальных клеток в пробирку для переваривания, чтобы инактивировать активность трипсина, и перенесите матки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую три миллилитра свежей среды для стромальных клеток эндометрия мыши. Осторожно встряхните пробирку с тканью в течение 10 секунд. Затем перенесите матки в чашку с холодным HBSS, после чего перенесите их в новую пробирку объемом 15 миллилитров со средой для стромальных клеток.

После третьего промывания тканей и переноса инкубируйте ткани матки в свежей смеси для переваривания стромальных клеток эндометрия мыши в течение 30 минут при 37 °C. По завершении переваривания пропустите клеточные суспензии из пробирок с первой по третью, а также из пробирки с трипсином через нейлоновое сито с размером пор 40 мкм и промойте сито дополнительными пятью миллилитрами среды для стромальных клеток эндометрия мыши. Затем соберите клетки путем центрифугирования.

Затем ресуспендируйте осадок в свежей среде для стромальных клеток эндометрия мыши для посева на покровные стекла, покрытые полилизином, с плотностью, соответствующей планируемому последующему анализу. Чистоту первичных клеточных культур можно оценить по различиям в экспрессии виментина и цитокератина, так как уровни виментина высоки в стромальных клетках эндометрия мыши и низки в эпителиальных клетках эндометрия мыши. В то же время уровни цитокератина высоки в эпителиальных клетках эндометрия мыши и низки в стромальных клетках эндометрия мыши.

Двойное окрашивание на ментин/цитокератин дополнительно иллюстрирует экспрессию ментина стромальными клетками, а также эксклюзивную экспрессию цитокератина эпителиальными клетками. Индукция децидуализации в культурах стромальных клеток путем применения циклического аденозинмонофосфата и MPA показывает, что уровни мРНК пролактина резко возрастают после пяти дней обработки по сравнению с контрольными культурами стромальных клеток. Поскольку эпителиальные клетки трудно визуализировать в inserts для культивирования клеток, анализ жизнеспособности можно провести сразу после пятидневного моделирования децидуализации, при этом изменение цвета с синего на ярко-розовый будет указывать на наличие жизнеспособных эпителиальных клеток.

После применения этого метода можно провести другие исследования, такие как анализы адгезии бластоцист, чтобы оценить, способны ли факторы, секретируемые эпителиальными клетками в присутствии бластоцисты, индуцировать децидуализацию стромальных клеток.