Анализ Synaptic модуляция Дрозофилы Фоторецепторы после экспозиции продолжительному воздействию света

Общая цель этой экспериментальной процедуры состоит в том, чтобы понять синаптическую динамику в одном нейроне при различных условиях активации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области синаптической пластичности, такие как выявление изменений в молекулярном составе синапсов по мере созревания активности нейрона. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить полуавтоматический анализ нескольких аспектов синапсов, включая их количество, распределение и уровень обогащения молекулярных компонентов после синапсов.

Для этого эксперимента соберите мух в обычные флаконы в течение шести часов после выведения. Загрузите флаконы для сбора в прозрачный акриловый стеллаж. В небольшом инкубаторе, настроенном на 25 градусов по Цельсию, расположите штатив на точном расстоянии от светодиодной панели, где освещенность составляет в среднем 1000 люкс.

Затем задние мухи летают в течение одного-трех дней, используя одно из следующих условий: либо постоянная темнота, 12 часов света с последующим 12 часами темноты, либо постоянный свет. Позже препарируйте и окрашивайте мозг с помощью стандартных методов. Чтобы установить мозги мухи, загрузите микропипетку с монтажным материалом и положите две капли по 2 микролитра в центр предметного стекла микроскопа на расстоянии около 2 см друг от друга.

Поместите защитный лист на каждую каплю с зазором примерно 0,2 мм. Затем нанесите 15 микролитров монтажной среды на покровные стекла и в зазор. Под препарирующим микроскопом поместите мозг в щель из микропипетки.

А затем расположите мозги вентральной стороной вверх. Наконец, прикрепите крышку и запечатайте ее по краям прозрачным лаком для ногтей. Затем мозг может быть визуализирован с помощью стандартных методов для воссоздания 3D-изображений.

В этом случае люминесценция GFP документируется в клетках с активной экспрессией Brp с помощью метода «звезда». Также в этом примере аксоны фоторецепторов R7 и R8 иммунолалировали антициаоптином, который рассматривали с использованием вторичных антител, помеченных RFP. Для количественной оценки численности, распределения и уровня делокализации Brp GFP puncta сначала были получены восстановленные 3D-изображения мозга, сделанные из стеков изображений.

Точки Brp отображаются белым цветом. Теперь найдите интересующий вас регион. В этом случае окончания аксона R8 располагаются путем утончения положительных аксонов антициаоптина в точке входа в слой мозгового вещества M3.

На каждой клемме аксона R8 идентификация точки Brp GFP с помощью модуля обнаружения пятен. Выберите «Добавить новые споты», затем в настройках алгоритма выберите «Сегментировать только интересующую область». После определения области анализа установите исходный канал на Brp GFP, а затем установите расчетный диаметр XY на 0,35 микрона.

А затем отметьте галочкой вычитание фона в точечном детектировании. Затем выберите качество в качестве типа фильтра, и точки будут отфильтрованы автоматически. Завершите этот шаг, нажав кнопку «Готово».

Повторите метод точечного обнаружения для всех аксонов R8 в наборе данных. Следующей областью, которую необходимо идентифицировать, является цитоплазма аксона. Сначала сгенерируйте объекты поверхности с помощью функции поверхности.

Затем выберите «Добавить новые поверхности» и в настройках алгоритма переключите параметр «Сегментировать только интересующую область». Теперь вручную выберите интересующую область. Далее задаем периметры расчета.

Чтобы найти фоторецепторный канал в качестве источника, выберите опцию smooth. В качестве порогового значения выберите абсолютную интенсивность. Включите опцию разделения соприкасающихся объектов.

Установите диаметр точек посадки на 0,5 микрона и используйте настройки фильтра по умолчанию для качества и количества вокселей. После этого фильтр применяется автоматически. Теперь перейдите к редактированию и удалите участки поверхности, созданные за пределами интересующей области.

В данном случае это другие аксоны. После повторения обнаружения области аксона для всех аксонов R8 в наборе данных все аксоны Brp puncta и R8 идентифицируются как набор точечных объектов. А соответствующие цитоплазматические участки идентифицируются как поверхностные объекты.

Теперь перейдите к ручному определению ориентации и пространства каждого аксона. Это важно для последующего количественного определения плотности Brp GFP вдоль каждого нейрона в мозговом мозге. Для этого сначала определим их начальные и конечные точки.

Выберите «Добавить новые точки измерения», затем нажмите «Редактировать», а затем выберите поверхность объекта для работы с верхней частью объектов поверхности. Чтобы определить начальные точки, поместите точки измерения на все объекты поверхности аксонов R в слое M1. Расположите эти точки в систематическом воспроизводимом порядке.

Затем определите конечные точки. Выберите «Добавить новые точки измерения», «Редактировать» и «Поверхность объекта» еще раз. Затем, повторяя тот же систематический порядок, поместите точки измерения на дно аксонов R в слое М3.

Чтобы количественно оценить интенсивность фона Brp, проанализируйте цитоплазматические области двух аксонов R7. Выберите «Добавить новые поверхности» и вручную определите область аксона R7, как это было сделано для аксонов R8. Используйте идентичные настройки, за исключением того, что не включайте опцию включения разделения соприкасающихся объектов.

Оставьте это выключенным. Затем добавьте объект-пустышку внутри определенной области аксона R7. Выберите «Добавить новые пятна», выберите «Пропустить автоматическое создание и редактировать вручную».

Затем выберите центр объекта и щелкните по объекту поверхности, чтобы поместить объект пустышки внутрь аксона R7. Теперь повторите шаги обнаружения поверхности и пятна для второго аксона R7. А затем определите начальную и конечную концевые точки аксонов R7, как это сделано с аксонами R8.

Для этого анализа убедитесь, что установлено правильное программное обеспечение. Откройте набор данных, содержащий данные о точках, данные поверхностей и два объекта точек измерения, каждый из которых содержит одинаковое количество точек измерения. Проверьте данные.

Для выполнения вычислений оба объекта точек измерения должны иметь одинаковое количество точек измерения. После того, как споты, области аксонов, а также начальная и конечная точки определены, запустите плагин. Во-первых, проверьте метаданные, в частности, размер воксела.

Откройте свойства изображения из редактирования, затем проверьте 3 измерения вокселя и микроны в разделе координаты в геометрии. Далее выберите канал для анализа интенсивности. В этом случае выбирается канал, показывающий Brp GFP.

Затем определите имя файла для результатов. Затем определите количество ячеек равным 10 и установите длину аксона равной 100%Затем определите области точки, установив радиус пятна на 0,35 микрона и окружающую цитоплазматическую область на 50 микрон. Наконец, выполните команду обнаружения синапсов, а затем проанализируйте выходные данные.

В соответствии с описанными протоколами были проанализированы точки Brp GFP в синапсах R8 мух, подвергшихся воздействию постоянной темноты, постоянного света или нормального цикла свет/темнота. Количество Brp puncta было значительно снижено в фоторецепторах R8 мух, находящихся при постоянном освещении. Распределение пунктов было рассчитано с помощью пользовательского плагина.

Синапсы R8 были распределены по всему аксональному стволу от слоя М1 до слоя М3, но их плотность была выше в слоях М1 и М3. Аналогичным образом рассчитывались уровни делокализации точек поражения. Они были неизменными во всех условиях, однако уровни делокализации Brp GFP отличались от других репортеров, например, Brp-short-cherry, которая становится явно размытой при постоянном освещении.

Не исключено, что имеет место ненадлежащая обработка короткого фрагмента Brp после разборки с АЗ. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как анализировать синаптические пластические свойства в одном нейроне. К таким пластическим свойствам относятся номер синапсов, их распределение, а также метка обогащения конкретным молекулярным компонентом после синапсов.