Быстрое Количественное митоген-индуцированной бластогенеза в Т-лимфоцитах для идентификации иммуномодулирующих препаратов

Общая цель этой процедуры заключается в оценке эффективности иммуномодулирующих препаратов с помощью автоматизированного счетчика клеток путем измерения бластогенеза Т-лимфоцитов или бластной трансформации. Этот анализ обеспечивает быстрый метод количественной оценки активации Т-лимфоцитов с использованием автоматического счетчика клеток, который оснащен для измерения диаметра клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет быстро, просто и напрямую измерять данные отдельных клеток, в отличие от обычных анализов пролиферации Т-лимфоцитов.

Лечение лимфоцитов иммуномодулирующими препаратами либо увеличивает, либо уменьшает скорость и степень клеточного бластогенеза. С помощью клеточного счетчика степень бластогенеза может быть измерена примерно за четыре минуты на образец. В течение десяти минут после жертвоприношения опрыскайте живот мыши 70-процентным этанолом и с помощью ножниц сделайте надрез на шерсти и коже с левой стороны животного.

Раздвиньте кожу и отведите назад, чтобы обнажить брюшину. Затем нанесите на место разреза четырехпроцентный хлоргексидин. С помощью второго набора ножниц и щипцов сделайте двух-трехсантиметровый надрез по центру живота, чтобы открыть брюшину.

Затем удалите висцеральные прикрепления и излишки жира вокруг селезенки и перенесите ткань в контейнер с DPBS. Затем добавьте десять миллилитров полной среды RPMI 1640 в десятисантиметровую чашку для культуры и раздавите селезенку между двумя стерилизованными предметными стеклами из матового стекла. Отфильтруйте тканевую суспензию через стерильное нейлоновое сетчатое фильтр размером 40 микрон в новую десятисантиметровую чашку для культур, чтобы удалить соединительные ткани и мусор, и перенесите одноклеточную суспензию в 50-миллилитровую коническую пробирку для центрифугирования.

Ресуспендируйте гранулу в 20 миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов. Через десять минут при комнатной температуре при легком покачивании соберите клетки с помощью еще одного центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в десяти миллилитрах свежей среды. Затем снова центрифугируют клетки для ресуспендирования в двух миллилитрах полной среды с температурой 37 градусов Цельсия.

Чтобы очистить Т-клетки, сначала промойте одну-две колонки из нейлоновой ваты на селезенку два раза пятью миллилитрами полного RPMI и поместите колонки в инкубатор для клеточных культур с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на один час. В конце инкубации загрузите два миллилитра выделенной суспензии спленоцитов на верхнюю часть каждой колонки и дайте клеткам пройти через колонку, пока жидкость не достигнет верхней части шерсти. Затем добавьте два миллилитра свежей среды 37 градусов Цельсия в верхнюю часть колонн и дайте среде пройти через нейлоновую вату, пока жидкость в верхней части колонки не достигнет верхней части шерсти.

Теперь накройте шерсть тремя миллилитрами 37 градусов Цельсия полной средой и верните колонку в инкубатор клеточной культуры, чтобы все В-клетки, фибробласты и добавочные клетки прилипли к волокнам шерсти. Через час в новой конической трубке объемом 50 миллилитров промойте колонку два раза пятью миллилитрами свежей готовой среды, чтобы вымыть неадгезивные Т-клетки. Затем соберите клетки путем центрифугирования.

После однократного промывания Т-клеток десятью миллилитрами полной среды повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах свежей полной среды. Затем подсчитайте клетки и разбавьте суспензию в концентрации от 0,5 до десяти до шести клеток на миллилитр в свежей полной среде для посева в шести- или 24-луночный планшет для культивирования клеток, в зависимости от экспериментальной целесообразности. В течение 24 часов после их выделения активируйте колонку нейлоновой шерсти, изолируйте Т-клетки с помощью соответствующего стимула и экспериментального препарата, представляющего интерес.

Через 12–72 часа с помощью пипетки объемом в один миллилитр аккуратно перемешайте активированные обработанные клетки, чтобы удалить любые комки. Чтобы измерить диаметр клеток с помощью автоматического счетчика клеток, переложите по одному миллилитру обработанных клеток из каждой лунки в отдельные чашки для образцов и поместите чашки для образцов в карусель образцов автоматического счетчика клеток. Введите идентификатор образца и информацию о типе ячейки, чтобы зарегистрировать образцы и начать их выполнение.

После смешивания трипанового синего с клеточной суспензией клетки пропускают через поле визуализации до тех пор, пока из каждого образца не будет собрано около 100 изображений клеток. Программное обеспечение рисует круг вокруг каждой обнаруженной трипановой и неокрашенной ячейки, чтобы определить диаметр ячейки. После того, как все ячейки были измерены, данные экспортируются в электронную таблицу, в которой отображаются результаты в виде общего и жизнеспособного количества клеток для каждого измеренного диаметра.

Затем данные могут быть представлены в виде гистограмм. После двух дней стимуляции ФМА и иономицином наблюдается значительный сдвиг медианы распределения частот в сторону большего диаметра клеток, при этом соответственно уменьшается количество Т-клеток с меньшим диаметром. При фиксированной концентрации иономицина в 250 наномоляров эффект PMA существенно не изменяется при повышении концентрации активационного стимула с 2 до 250 нанограмм на миллилитр.

Также не наблюдается заметной разницы в пролиферации Т-клеток. Препараты-ингибиторы кальциневрина частично подавляют как бластогенез Т-клеток, так и пролиферацию. Лечение Т-клетками иммуносупрессивными соединениями, нацеленными на ядерный фактор кальциневрина активированных Т-клеток, ингибирует бластогенный ответ почти на 72 процента.

Рапамицин и FTY720 демонстрируют умеренное, но статистически значимое влияние на бластогенез. В то время как TRAM34, по-видимому, не влияет на пролиферацию Т-клеток мышей даже при концентрации 700 наномоляров. Когда рапамицин и циклоспорин А используются вместе, бластогенез полностью подавляется.

Аналогичные результаты наблюдаются с мышиными Т-клетками, активированными анти-CD3 и анти-CD28 конъюгированными магнитными шариками. Этот анализ может быть использован для успешной количественной оценки эффектов различных иммуномодулирующих препаратов, что дает лучшую оценку эффективности препарата по сравнению с типичными пролиферативными анализами, которые также включают вклад апоптотических и некротических клеток. С помощью этого метода можно измерить до 15 образцов внутрь и наружу, что позволяет одновременно и впоследствии количественно оценить как бластогенез, так и скорость пролиферации.

Иногда пузырьки воздуха могут попадать в проточную ячейку, что делает измерение непригодным для использования, поэтому все изображения должны быть проверены на наличие пузырьков воздуха, прежде чем данные каждого испытания будут приняты для анализа. Одним из ограничений этой процедуры является то, что если в образце слишком много мусора, при измерении мусор может рассматриваться как жизнеспособные клетки. При наличии подходящих модификаций этот анализ может быть адаптирован для изучения изменения размеров клеток нейтрофилов и гепатоцитов.