Аптамер на основе датчика для нехелатированной гадолиния (III)
9 января 2017 г.
Описано использование молекул полидезоксинуклеотида (44-мерного аптамера) для восприятия нехелатированного иона гадолиния(III) в водном растворе. Присутствие иона обнаруживается по увеличению флуоресцентного излучения датчика.
Общая цель этого флуоресцентного анализа заключается в обнаружении присутствия токсичного нехелатного иона гадолиния в водных растворах, содержащих контрастные вещества для магнитно-резонансной томографии. Этот метод может помочь облегчить использование контрастных веществ на основе гадолиния для МРТ, обеспечивая средства для обеспечения высокого паритета синтезированных агентов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он способен обнаруживать субмикромолярную концентрацию нехелатного токсичного гадолиния с относительно высокой селективностью по отношению к другим биологическим катионам металлов.
Чтобы начать эту процедуру, подготовьте буфер для анализа, как указано в текстовом протоколе. Используя гидроксид натрия и соляную кислоту, отрегулируйте pH до 7,4. Затем отфильтруйте буфер через стерильный одноразовый фильтр на крышке бутылки с мембраной PES 0,2 микрона.
Затем перелейте 497 микролитров буфера для анализа в свежую микроцентрифужную пробирку. Добавьте один микролитр приготовленного стокового раствора гадолиния аптамера и два микролитра приготовленного стокового раствора QS. Перелейте по 50 микролитров этого раствора гадолиниевого сенсора 2X в каждую из девяти ПЦР-пробирок.
После этого поместите трубки в термоамплификатор. Установите термоамплификатор на нагрев образцов до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, затем медленно охладите растворы до 25 градусов Цельсия в течение 15 минут. Важно помнить о том, что растворы датчиков гадолиния 2X должны нагреваться до 95 градусов, а затем медленно охлаждаться до комнатной температуры перед добавлением раствора ионов гадолиния.
Для начала растворите твердый трихлорид гадолиния в буфере для анализа, чтобы получить три стоковых раствора гадолиния нужной концентрации. Используя серийное разведение, приготовьте шесть растворов гадолиния по 100 микролитров, как указано в текстовом протоколе. После этого растворите испытуемый контрастный агент в буфере для анализа.
Используйте серийное разбавление для приготовления трех различных концентраций. Затем извлеките из термоамплификатора ПЦР-пробирки, содержащие раствор гадолиниевого сенсора 2X. Перенесите по 50 микролитров каждого раствора гадолиния в отдельные ПЦР-пробирки.
Пипеткой каждый раствор вверх и вниз несколько раз перемешать. Далее перенесите по 50 микролитров раствора каждого контрастного средства отдельно в оставшиеся ПЦР-пробирки. Перемешайте с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
Инкубируйте все девять растворов в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого переложите по 45 микролитров каждого раствора в 384 луночный планшет в двух экземплярах. Затем запишите и проанализируйте данные флуоресценции, как указано в текстовом протоколе.
В данном исследовании нехелатный трехвалентный ион гадолиния был обнаружен в водном растворе с помощью метода, основанного на флуоресценции. Флуоресцентный датчик разрабатывается путем присоединения флуорофора к аптамеру. Затем датчик гибридизуется с гасительной нитью, которая помечается темной молекулой гасителя.
Добавление гадолиния 3 вытесняет гасящую цепь из аптамера, вызывая увеличение флуоресцентного излучения. Калибровочные кривые получают с использованием 100 наномолярного гадолиниевого аптамера и 200 наномолярного QS и отображают либо необработанную флуоресценцию, либо флуоресцентное изменение. Обе кривые показывают линейный диапазон для трех концентраций гадолиния ниже одного микромоляра и насыщение сигнала при концентрациях более трех микромоляров.
Затем две разные партии гадотеровой кислоты анализируются на концентрации в диапазоне от нуля миллимоляров до 20 миллимоляров. В то время как флуоресцентное излучение образца высокой чистоты заметно не увеличивается в этом диапазоне, значительное изменение наблюдается в образце, содержащем нехелатный гадолиний-3 в концентрациях до пяти миллимоляров. При попытке выполнить эту процедуру важно убедиться, что в лунках микропланшета нет пузырьков воздуха, так как это изменит показания флуоресценции.
Используя эту процедуру, мы можем обнаружить даже небольшие количества рассчитанных ионов гадолиния в растворах, содержащих контрастные вещества. Это будет хорошим методом для определения чистоты веществ. Работа с химическим веществом может быть опасной, и при выполнении этой процедуры важно соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен флуоресцентный метод анализа для обнаружения токсичных нехелатированных ионов гадолиния(III) в водных растворах. В методе используются молекулы полидезоксинуклеотидов (44-мерный аптамер), которые демонстрируют усиление флуоресцентного излучения в присутствии ионов гадолиния.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биохимия
- Аналитическая химия
Теоретическая часть
- Ионы гадолиния(III) используются в контрастных веществах для МРТ.
- Нехелатные ионы гадолиния могут быть токсичны в биологических системах.
- Флуоресцентный анализ обеспечивает чувствительный метод обнаружения.
- Высокая селективность имеет решающее значение для отличия гадолиния от других катионов металлов.
Цель исследования
- Разработать надежный метод анализа для обнаружения нехелатированных ионов гадолиния.
- Обеспечить безопасность контрастных веществ для МРТ на основе гадолиния.
- Добиться обнаружения при субмикромолярных концентрациях.
Используемые методы
- Приготовление рабочего буфера с доведением pH до 7,4.
- Фильтрация буфера через стерильный фильтр.
- Использование полидезоксинуклеотидных аптамеров для сенсинга.
- Измерение изменений интенсивности флуоресценции в присутствии ионов гадолиния.
Основные результаты
- Метод позволяет успешно обнаруживать ионы гадолиния в низких концентрациях.
- Была достигнута высокая селективность по отношению к другим биологическим катионам металлов.
- В присутствии гадолиния наблюдалось значительное увеличение интенсивности флуоресценции.
- Данный метод может повысить безопасность использования контрастных веществ при МРТ.
Выводы
- Данный флуоресцентный анализ эффективен для мониторинга уровней ионов гадолиния.
- Он позволяет обеспечить контроль качества препаратов на основе гадолиния.
- Будущие области применения могут включать более широкий экологический и биологический мониторинг.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Обнаружение нехелатированных ионов гадолиния(III) имеет решающее значение для обеспечения безопасности и качества контрастных веществ для МРТ на основе гадолиния, используемых в клинической диагностике. Этот флуоресцентный сенсор на основе аптамеров позволяет обнаруживать токсичные Gd³⁺ в водном буфере в субмикромолярных концентрациях, что способствует разработке анализов на ранних этапах для тестирования чистоты контрастного вещества. Данный метод обеспечивает селективный и воспроизводимый результат, который помогает снизить механистические риски в процессе идентификации ведущих соединений и доклинического скрининга рецептур.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать стабильность хелатов гадолиния и эффективность связывания лигандов при разработке контрастных веществ.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию химии хелатирования путем обнаружения продуктов диссоциации.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные показатели флуоресценции для оценки чистоты контрастного вещества в серии разведений.
- Практическая ценность: Совместимость с форматом 384-луночных микропланшетов обеспечивает возможность высокопроизводительного скрининга партий контрастного вещества.
- Практическая ценность: Демонстрирует селективность по отношению к физиологическим ионам (Na⁺, K⁺, Ca²⁺), что снижает количество ложноположительных результатов в сложных матрицах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Представляет собой релевантную для изучения заболеваний систему мониторинга высвобождения гадолиния в условиях, имитирующих биологические среды.
- Практическая ценность: Позволяет принимать обоснованные с точки зрения рисков решения о дальнейшем развитии препарата путем количественного определения остаточного нехелатного Gd³⁺ при скрининге рецептур.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в процесс разработки — от раннего скрининга контрастных веществ до доклинической оценки безопасности, где определение остаточных ионов металлов служит основой для оптимизации состава и принятия решений о целесообразности дальнейшего исследования.
- Биология открытий: Позволяет проверить гипотезы о стабильности хелатов и силе взаимодействия лигандов с ионами в водных средах.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа и воспроизводимость для межсерийного сравнения чистоты контрастных веществ.
- Аналитика: Обеспечивает количественное измерение зависимой переменной (кратность изменения флуоресценции), что позволяет сравнивать концентрации Gd³⁺ в различных образцах.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преклиническую преемственность за счет имитации биологических условий, при которых может происходить диссоциация гадолиния.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой многократно используемый аналитический инструмент для контроля качества при производстве контрастных веществ и тестировании их стабильности.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в прогнозировании безопасности контрастных веществ за счет обнаружения токсичного Gd³⁺ на наномолярном уровне.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря измерениям флуоресценции в буферно-контролируемой среде со стабилизированным pH.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о дальнейшем использовании («go/no-go») путем выявления партий с остаточным нехелатированным гадолинием перед доклиническим выпуском.
- Влияние на портфель разработок: позволяет осуществлять приоритезацию кандидатов в контрастные вещества на основе оценки рисков, исходя из эффективности хелатирования и удерживания ионов металлов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с нуклеиновыми кислотами, гибридизацией аптамеров и флуоресцентным детектированием.
- Необходимы термоциклеры для отжига гасящих цепей аптамеров и планшетные ридеры для количественного определения флуоресценции.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов приготовления буфера, регулировки pH и фильтрации.
- При расширении метода на другие лантаноиды следует учитывать необходимость адаптации из-за частичной перекрестной реактивности с Eu³⁺ и Tb³⁺.
- Ограничено отсутствием абсолютной специфичности к Gd³⁺ по сравнению с другими трехвалентными лантаноидами, что требует ортогонального подтверждения в сложных образцах.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
4:33
Conclusion
0:36
Preparation of Aptamer Stock Solutions and 2x Gd-sensor Solution
1:52
Constructing the Fluorescence Calibration Curve and Detecting the Presence of Unchelated Gd3+ in a Solution of Gd Contrast Agent
3:15
Results: Changes in the Fluorescence Emission of the Aptamer-based Sensor in the Presence of Gadolinium(III)
