Анализ сегрегации хромосом, ацетилирование гистонов и морфология веретена в ооцитах лошадей
11 мая 2017 г.
Эта рукопись описывает экспериментальный подход к морфологическим и биохимическим характеристикам ооцитов лошадей. В частности, в настоящей работе показано, как собирать незрелые и зрелые ооциты лошади с помощью ультразвукового наводящего пипетки (OPU) и как исследовать сегрегацию хромосом, морфологию веретена, глобальное ацетилирование гистонов и экспрессию мРНК.
Общие цели этого экспериментального подхода заключаются в том, чтобы, во-первых, морфологически и биохимически охарактеризовать ооциты лошади и, во-вторых, сравнить гаметы того же животного, которые были обработаны in vitro или in vivo. Этот экспериментальный подход может помочь ответить на ключевые вопросы биологии ооцитов и фертильности у моновуляторных видов. Это также может повысить безопасность процедур манипуляции с гаметами.
Этот подход был разработан для преодоления ограниченной доступности образцов ооцитов, особенно моновуляторных видов. Демонстрировать процедуры OPU будут профессор Стефан Делёз из Льежского университета, Сесиль Дуэ, руководитель моей лаборатории, и Фабрис Рейнер, менеджер отделения лошадей в центре INRA в Валь-де-Луаре. Ежедневно оценивайте диаметр фолликулов яичников в когорте взрослых кобыл с помощью ультразвука.
Ищите большой фолликул диаметром более 33 миллиметров. После того, как он будет найден, приготовьтесь к введению 1500 единиц хорионического гонадотропина человека, чтобы индуцировать созревание ооцита в доминантный фолликул. Далее найдите яремную борозду, и промокните место инъекции спиртом.
Затем, чтобы вена поднялась, приложите некоторую силу на два-три сантиметра ниже места инъекции. Введите иглу почти параллельно горлышку, слегка аспирируйте, чтобы игла находилась в вене, и введите гормон. Подготовьте ультразвуковой зонд для вагинального доступа.
Через 35 часов после инъекции ХГЧ настройте инструменты для ОПУ и успокойте кобылу. Хорошая анальгезия чрезвычайно важна для безопасности животного и оператора.
Животное, которое не чувствует боли или дискомфорта, позволит проводить манипуляции с яичником, облегчая выполнение проколов и промываний. После введения игольчатого зонда один оператор должен манипулировать яичником так, чтобы он был обращен к зонду, в то время как другой оператор манипулирует иглой. Найдите доминантный фолликул на эхографическом изображении.
Затем с помощью иглы прокалывают стенку влагалища и стенку доминантного фолликула. Как только доступ к фолликулярному пространству будет получен, аспирируйте фолликулярную жидкость. Вращайте иглу, чтобы соскоблить фолликулярную стенку и присоединить кумулюс-ооцитарный комплекс.
Затем перелейте жидкость в большую чашку Петри. И под стереоскопом искать КОК. Тем временем промойте фолликул теплым модифицированным PBS Дульбекко, содержащим гепарин.
Для сбора COC может потребоваться несколько смывов. После того, как КОК будет найден, замените иглу на иглу с двойным просветом и соберите незрелые КОК из всех фолликулов диаметром от пяти до 25 миллиметров. Они будут использоваться для созревания in vitro.
После того, как все фолликулы из одного яичника будут аспирированы, повторите те же процедуры, чтобы собрать незрелые КОК из другого яичника. Теперь выберите один из COC. Храните только КОК с несколькими полными слоями кучевых клеток и коричневой мелкозернистой ооплазмой.
Отбросьте остальные. В конце процедуры введите кобыле 15 000 единиц бензил-пенициллина для предотвращения инфекции. Затем поместите кобылу в тихую, чистую конюшню не менее чем на два часа, пока она не выздоровеет.
Перед началом OPU прогрейте флакон с дополненным HEPES-буфером TCM-199 до 37 градусов Цельсия. Далее подготовьте среду IVM. Налейте 500 микролитров добавленного бикарбоната натрия TCM-199 в лунки четырехлуночной чашки.
Затем выдержите блюдо при температуре 38,5 градусов Цельсия не менее двух часов. Переложите восстановленные незрелые КОК в 3,5-сантиметровую миску, наполненную двумя миллилитрами подогретого HEPES TCM-199. Перемещайте КОК по разным частям посуды, чтобы аккуратно смыть окружающий мусор.
Теперь перенесите КОК в среду IVM и инкубируйте их в течение 28 часов при температуре 38,5 градусов Цельсия. Чтобы провести подсчет хромосом на зрелых КОК, инкубируйте их в 100-микромолярном монастроле в течение часа при температуре 38,5 градусов Цельсия. Затем удалите кумулюсные клетки, обработав КОК 0,5% гиалуронидазой в HEPES-буферизованном TCM-199.
Следите за этой реакцией на нагретой сцене, установленной на 38 градусов по Цельсию. В течение примерно пяти минут удалите все ячейки. С помощью щадящего пипетирования удалите последние несколько упрямых клеток.
Затем удалите zona pellucida с помощью 0,2% проназы в HEPES-буферизованном TCM-199. Следите за этой реакцией и на нагретой сцене. Это должно занять около пяти минут.
Затем зафиксируйте ооциты в 4% параформальдегиде в DPBS в течение 15 минут при 38,5 градусах Цельсия, а затем еще 45 минут фиксации при четырех градусах Цельсия. После фиксации ооциты промыть путем последовательного переноса их между тремя лунками 0,1%-ного поливинилового спирта в ДПБС. Используйте примерно полмиллилитра раствора на лунку.
Затем перенесите ооциты в лунку, наполненную 0,3% Triton X-100 в PBS, и дайте им инкубироваться в течение 10 минут при комнатной температуре. Чтобы блокировать неспецифические сигналы, купайте клетки в DPBS с 1% BSA и 10% обычной ослиной сыворотки. Инкубируйте клетки не менее 30 минут при комнатной температуре.
Через 30 минут нанесите первичное антитело, а затем инкубируйте клетки при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день промойте ооциты и нанесите вторичное антитело на час при комнатной температуре, защищенное от воздействия света. После применения вторичного ооцитов снова промойте яйцеклетки.
Затем, перед монтажом, прикрепите к горкам полосы из двустороннего скотча, которые будут служить опорами для покровного стекла. Теперь установите ооциты по три-четыре на предметное стекло в каплю незатвердевающей, предотвращающей выцветание монтажной среды, дополненной 20 микромолярами YO-PRO-1. Дайте ооцитам отстояться около 10 минут, а затем наложите покровные листы.
Из 32 КОК, полученных с помощью ОПУ из доминантных фолликулов, 28 находились в метафазе II. Используя созревание in vitro, 37 из 44 КОК, собранных из недоминантных фолликулов, были созрели до метафазы II. Затем были сравнены хромосомы обеих групп. Созревшие in vitro яйцеклетки часто поражались анеуплоидией, в основном гиперплоидией. Этого не наблюдалось у созревших in vivo яйцеклеток.
Затем были измерены длина шпинделя от полюса до полюса и диаметр шпинделя на его максимальном уровне. Созревшие in vitro ооциты были значительно длиннее и шире, чем созревшие in vivo ооциты. В тех же образцах был измерен глобальный уровень ацетилирования H4K16.
Результаты оказались ожидаемыми. Ацетилирование H4K16 было значительно ниже в яйцецитах, созревших in vitro, чем в яйцецитах, созревших in vivo. Хорошо обученная команда может обработать пять кобыл за утро OPU с 80% извлечением преовуляторных ооцитов и 50-60% извлечением незрелых ооцитов.
Во время OPU всегда следите за самочувствием и благополучием животного и будьте готовы оказать надлежащую ветеринарную помощь в случае необходимости. Экспериментальный подход может быть применен и к ооцитам других видов и особенно применим там, где доступность образцов является проблемой, например, у человека. Основываясь на наших результатах, необходимо провести исследования, чтобы лучше понять условия культивирования, необходимые для правильной сегрегации хромосом и эпигенетических изменений.
Главная цель состоит в том, чтобы повысить эффективность созревания in vitro как для ветеринарии, так и для лечения бесплодия человека.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной рукописи представлен экспериментальный подход к морфологической и биохимической характеристике ооцитов лошадей. В работе подробно описывается сбор незрелых и зрелых ооцитов лошадей с помощью ультразвукового забора яйцеклеток (OPU), а также исследуются сегрегация хромосом, морфология веретена деления, общий уровень ацетилирования гистонов и экспрессия мРНК.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология ооцитов
- Фертильность у моноовуляторных видов
- Процедуры манипуляции с гаметами
Теоретические основы
- Понимание характеристик ооцитов имеет решающее значение для исследований в области фертильности.
- Для моноовуляторных видов доступность ооцитов ограничена.
- OPU под контролем УЗИ может улучшить сбор образцов.
- Сравнительный анализ гамет, обработанных in vitro и in vivo, является необходимым.
Цель исследования
- Провести морфологическую и биохимическую характеристику ооцитов лошадей.
- Сравнить гаметы одного и того же животного, обработанные в разных условиях среды.
- Повысить безопасность процедур манипуляций с гаметами.
Используемые методы
- Ультразвуковой пункционный забор яйцеклеток (OPU) для сбора ооцитов.
- Оценка диаметра фолликулов яичников у взрослых кобыл.
- Исследование сегрегации хромосом и морфологии веретена деления.
- Анализ общего ацетилирования гистонов и экспрессии мРНК.
Основные результаты
- Успешный сбор незрелых и зрелых ооцитов лошади.
- Представления о сегрегации хромосом и морфологии веретена деления.
- Данные об общих уровнях ацетилирования гистонов.
- Установлены профили экспрессии соответствующих мРНК.
Выводы
- Данное исследование закладывает основу для характеристики ооцитов лошадей.
- Полученные результаты могут расширить понимание фертильности у моноовуляторных видов.
- Методы OPU позволяют повысить безопасность манипуляций с гаметами.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Характеристика биологии ооцитов у моноовуляторных видов позволяет устранить критический барьер в репродуктивных исследованиях и разработках, где ограниченная доступность образцов препятствует изучению механизмов. Данный подход позволяет провести сравнительный анализ эффектов созревания in vitro и in vivo на целостность хромосом и эпигенетическую регуляцию, что дает прогностические данные для оптимизации условий культивирования. Такие данные способствуют снижению рисков при использовании технологий вспомогательной репродукции за счет выявления индуцированной культивированием анеуплоидии и дефектов веретена деления до их клинического внедрения.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать механизмы точности мейоза путем количественного определения частоты анеуплоидии как функционального показателя способности к сегрегации хромосом.
- Научная ценность: профилирование ацетилирования гистонов (H4K16) связывает эпигенетическое состояние с морфологией веретена деления, что подтверждает целесообразность валидации путей HDAC/HAT при созревании ооцитов.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированную цитологическую основу для оценки параметров качества ооцитов, применимую для различных видов с ограниченным доступом к ооцитам.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Количественная морфометрия хромосом и веретена деления позволяет установить объективные и воспроизводимые показатели для оценки условий культивирования при созревании.
- Практическая ценность: Протоколы иммуноокрашивания на тубулин и ацетилированные гистоны создают переносимые методы анализа для высокопроизводительного скрининга эпигенетических модификаторов.
- Научная ценность: Анализ стабильности мРНК с помощью qPCR в условиях транскрипционного сайленсинга дает информацию для идентификации мишеней посттранскрипционной регуляции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Прямое сравнение ооцитов, созревших in vitro и in vivo, полученных от одного и того же животного, позволяет выделить эффекты, специфичные для культивирования, что повышает трансляционную значимость доклинических моделей.
- Практическая ценность: Устанавливаются эталонные размеры веретена деления и пороги ацетилирования для определения физиологических состояний созревания у видов с ограничениями моноовуляции.
- Научная ценность: Наборы данных о модификациях гистонов способствуют поиску биомаркеров для прогнозирования компетентности ооцитов в протоколах вспомогательных репродуктивных технологий.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод соответствует фазе поисковой биологии, в которой понимание механизмов качества гамет служит основой для валидации мишеней на начальных этапах и разработки аналитических методов на последующих этапах создания репродуктивных терапевтических средств.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о вызванной культивированием эпигенетической дисрегуляции и ее влиянии на точность сегрегации хромосом.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные количественные показатели (количество хромосом, морфометрия веретена деления, уровни ацетилирования) для оценки влияния соединений или условий на созревание ооцитов.
- Аналитика: позволяет получить измеримые результаты (частота анеуплоидии, интенсивность H4K16, размеры веретена деления) для статистического сравнения экспериментальных групп.
- Трансляционные исследования: связывает результаты in vitro с контрольными показателями in vivo, снижая риск ошибок при экстраполяции данных между видами при разработке доклинических моделей фертильности.
- Прикладное применение: протоколы OPU и фиксации создают многократно используемую платформу для характеристики ооцитов, применимую и к другим моноовуляторным видам с ограниченным количеством доступных образцов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов безопасности протокола созревания за счет прямой связи условий культивирования с показателями эпигенетической и хромосомной целостности.
- Операционная ценность: Стандартизированные рабочие процессы сбора и обработки ооцитов повышают воспроизводимость результатов в разных лабораториях и для разных видов.
- Стратегическая ценность: Раннее выявление индуцированных культивированием мейотических дефектов снижает риск неудач на поздних этапах разработки вспомогательных репродуктивных технологий.
- Влияние на портфель: Приоритизация составов сред для созревания на основе данных о порогах анеуплоидии и нормальности веретена деления.
Особенности реализации
- Для точного анализа хромосом и веретена деления требуются навыки работы с ооцитами, микроманипулирование и использование флуоресцентной микроскопии.
- Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия и системы с подогреваемым столиком необходимы для фиксации и визуализации мейотических структур с временным разрешением.
- Межлабораторная стандартизация валидации антител (тубулин, H4K16ac) и протоколов заключания препаратов обеспечивает сопоставимость количественных данных.
- Адаптация метода для разных видов требует оптимизации порогов размера фолликулов при OPU и дозировок гормонов с учетом особенностей репродуктивной физиологии.
- Ограничения включают низкий выход ооцитов за одну сессию и невозможность оценки транскрипционной активности из-за глобального сайленсинга в процессе созревания, что смещает акцент на посттранскрипционную регуляцию.
