Всеобъемлющая процедура для оценки

Общая цель данной процедуры заключается в оценке поведения противоопухолевых нанопрепаратов in vivo на системном, тканевом, клеточном и субклеточном уровнях у иммунокомпетентных мышей с опухолями. Этот метод позволяет ответить на ключевой вопрос в области наномедицины при лечении рака: как именно нанопрепараты количественно накапливаются в различных тканях живых животных с течением времени?

Основным преимуществом данного метода является то, что такой подход с двойной маркировкой позволяет проводить характеристику нанолекарственных препаратов in vivo на уровнях от макроскопического до микроскопического. В качестве примера для демонстрации нашей процедуры мы выбрали липосомы, так как они в настоящее время используются в клинике, а также являются распространенной платформой для экспериментальных нанолекарственных препаратов. Для начала процедуры растворите 20 milligrams липидной смеси, содержащей 0.1% по молю липофильного катионного флуоресцентного красителя, в двух milliliters хлороформа.

Затем высушите липиды с помощью роторного испарителя. Добавьте 20 milliliters фосфатно-солевого буферного раствора к высушенным липидам. Обработайте смесь ультразвуком на льду с помощью зондового соникатора 3.8 millimeter при мощности 30 watts в течение 30 minutes, поддерживая температуру смеси в диапазоне от четырех до 20 degrees Celsius на протяжении всего процесса.

Центрифугируйте полученную суспензию липосомальных наночастиц при 4,000 G в течение 10 минут. Удалите осадок и промойте липосомы раствором PBS, используя центрифужный фильтр с пределом отсечения молекулярной массы (MWCO) 100 килдальтон при 4000 G. Перенесите сконцентрированные липосомы из верхней камеры в новую центрифужную пробирку. Липосомы можно хранить в PBS в холодильнике до одной недели.

Проведите динамическое рассеяние света для смеси 50 µL очищенной суспензии липосом и 950 µL PBS. Измерьте размер частиц и определите распределение по размерам. Для начала процедуры радиомаркировки перенесите в пробирку объемом 1.5 mL необходимый объем очищенных липосом и PBS, чтобы получить 2 mg липидов.

Добавьте к этому одну мКи иоксалата циркония-89 до конечного объема 100 µL и pH от 6,9 до 7,1. Перемешивайте смесь при 37 °C в течение двух часов. Затем удалите свободный цирконий-89 с помощью центрифужного фильтрования с использованием фильтрующего модуля с порогом отсечения 100 kDa при 4 000 ×g. Промойте ретентат стерильным PBS трижды при 4 000 ×g. После этого разведите ретентат примерно до 3 мКи/µL для инъекции.

Используйте ВЭЖХ с эксклюзионным разделением в сочетании с радиационным детектором для определения радиохимической чистоты радиоактивно меченных липосом. Если радиохимическая чистота ниже 95%, повторно приготовьте дозу. Используйте метод динамического рассеяния света, чтобы подтвердить, что значения размера частиц и их распределения аналогичны показателям немеченных липосом.

Для начала процедуры визуализации введите около 300 microcurie радиоактивно меченных липосом в хвостовую вену зафиксированной мыши с меланомой. Через две минуты после инъекции с помощью инсулинового шприца с иглой 28 G возьмите от 10 до 20 µL крови из хвостовой вены мыши. Перенесите образец крови в предварительно взвешенную пробирку для подсчета.

Взвесьте образец крови и измерьте активность с помощью гамма-счетчика. Рассчитайте концентрацию радиоактивности как процент введенной дозы на грамм. Через пятнадцать минут после инъекции соберите и измерьте еще один образец крови аналогичным образом.

Затем проведите анестезию мыши путем подачи 2% isoflurane и кислорода через носовую маску. Соберите и измерьте третью пробу крови через один час после инъекции. После этого поместите мышь в клетку для восстановления до полного возвращения нормальной подвижности.

Соберите дополнительные образцы через четыре, восемь, 24 и 48 часов после инъекции. Дайте мыши полностью восстановиться между инъекциями. Содержите мышь в помещении, предназначенном для животных, которым вводили радиоактивные материалы.

Через 24 или 48 часов после инъекции липосом подвергните мышь наркозу с использованием 2% isoflurane и кислорода. Поместите мышь на живот на стол микро-ПЭТ/КТ-сканера для мелких животных. Продолжайте подачу 2% isoflurane и кислорода через носовую маску.

Нанесите ветеринарную мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить их пересыхание. Затем поместите ложе сканера в прибор. Выполните 15-минутное статическое ПЭТ-сканирование всего тела с регистрацией не менее 50 миллионов совпадающих событий при энергии от 250 до 700 кэВ и окне совпадений шесть наносекунд.

Затем проведите пятиминутное КТ-сканирование со 120 ротационными шагами в диапазоне 220 градусов, при экспозиции примерно 145 мс на кадр. Сразу после завершения сканирования подвергните мышь эвтаназии путем асфиксии углекислым газом. Подтвердите смерть, сжав лапу животного, после чего выполните подвывих шейных позвонков.

Проведите перфузию тканей раствором PBS для удаления крови, после чего возьмите соответствующие образцы тканей. Взвесьте собранные ткани и измерьте их активность. Рассчитайте накопление радиоактивно меченных липосом в тканях как процент от введенной дозы на грамм.

Храните ткань опухоли в холодном PBS. Выполните проточную цитометрию ex vivo и иммунофлуоресцентную визуализацию полученной ткани опухоли, чтобы измерить накопление в зависимости от клеточных популяций. ПЭТ/КТ-визуализация мышей с опухолями, которым вводили наночастицы, меченные цирконием-89, показала значительное накопление наночастиц в ткани опухоли через 24 часа после инъекции.

Период полувыведения наночастиц из крови составил приблизительно 10 часов. Результаты измерения биораспределения ex vivo через 24 часа после инъекции соответствовали данным ПЭТ/КТ in vivo. Затем с помощью методов иммуноокрашивания было изучено накопление наночастиц на уровне отдельных клеток.

Методом проточной цитометрии было установлено, что наночастицы преимущественно накапливаются в опухоль-ассоциированных макрофагах. Иммунофлуоресцентная визуализация образцов опухоли также указала на специфическое воздействие наночастиц на эндотелиальные клетки. Данный метод может помочь исследователям определить перспективные нанопрепараты для внедрения в клиническую практику.

После освоения эта методика при правильном выполнении может быть реализована за три дня. При радиоактивном мечении нанолекарственных препаратов важно применять высокие стандарты контроля качества. Следуя данной процедуре, можно проводить мечение других нанолекарственных средств, таких как наноэмульсии, полимерные наночастицы, мицеллы, антитела и фрагменты антител, для оценки их эффективности in vivo на мышах с опухолями.