Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных Микобактерии туберкулеза

Общая цель данного протокола состоит в том, чтобы обеспечить многомерную оценку того, как соединения влияют на выживаемость M.tuberculosis внутри макрофагов человека. Этот метод основан на анализе эффективности на основе люциферазы. В сочетании с цитотоксичностью анализ MIC может предоставить полезную информацию о модификации соединений HIT при разработке лекарств от туберкулеза.

Главное преимущество нашего метода в том, что он позволяет экономить время и труд. Он заменяет анализ колониеобразующей единицы КОЕ анализом на основе люциферазы. Как правило, люди, плохо знакомые с этой техникой, будут испытывать трудности с последовательностью ручного пипетирования вместо автоматизации.

Последовательная техника пипетирования имеет решающее значение. Выращивание клеток THP1 в RPMI в полной среде. При этом сохраняется плотность клеток от 0,2 до одного миллиона клеток на миллилитр среды между пассажами.

Используйте спектрофотометр для измерения OD600 активно растущей бактериальной суспензии. Затем рассчитайте бактериальную плотность, используя коэффициент пересчета 0,1 OD600, равный трижды по 10 с точностью до седьмой бактерии на миллилитр. Отпидайте достаточное количество бактерий для MOI 10 к одному в новую центрифужную пробирку.

Затем гранулируйте бактерии в 3 000 раз G в течение 10 минут. Чтобы опсонизировать бактерии, добавьте 50 микролитров человеческой сыворотки в 450 микролитров RPMI 1640 и используйте ее для ресуспендирования бактериальной гранулы в плотности от одного умноженного на 10 до восьмой бактерии на 500 микролитров среды. Дайте смеси настояться при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Далее с помощью гемоцитометра и инвертированного микроскопа определяют плотность культуры клеток THP1. Затем в стерильных центрифужных пробирках гранулируйте клетки при 100-кратном перегрузке при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в RPMI в полной среде с плотностью один миллион клеток на миллилитр.

Добавьте PMA до конечной концентрации 40 нанограмм на миллилитр. Это дифференциация микса. Комбинированный опсонизированный M.tuberculosis со смесью дифференцировки THP1 при MOI 10 к одному.

И в конечном итоге перемешайте по 100 микролитров на лунку в 96 лунок с белым плоским дном. Затем дайте дифференцировке и инфекции инкубироваться при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% углекислого газа, в течение ночи. На следующий день используйте 100 микролитров RPMI для двукратной промывки лунок.

Затем добавить разведенные до нужных концентраций соединения и РПМИ в готовую среду. Инкубируйте пластины в течение трех дней. При использовании многоканальных пипеток не забывайте практиковать медленное и устойчивое действие поршня и всегда помещайте наконечники пипеток в одно и то же место внутри каждой лунки, чтобы свести к минимуму повреждение элементов THP1.

После инкубации отсасывайте среду из лунок и добавьте в каждую лунку по 50 микролитров реактива люциферазного анализа. Затем используйте прозрачные клеевые герметики для запечатывания пластин. Инкубируйте планшеты при температуре 22 градуса Цельсия в течение пяти минут, затем используйте люминометр для получения показаний со скоростью одна секунда на лунку.

Для дифференцировки клеток THP1 после приготовления дифференцировочной смеси, как было показано ранее в этом видео, распределите по 100 микролитров дифференцировочной смеси в каждую лунку прозрачной 96-луночной пластины клеток. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе с 5% углекислым газом в течение ночи. На следующий день отсадите среду из лунок и дважды промойте их с помощью RPMI 1640.

Добавьте в лунки 100 микролитров составов, разведенных в неполном объеме РПМИ. Затем инкубируйте клетки в течение трех дней. Растворите 0,5 грамма МТТ в 100 миллилитрах PBS, чтобы получился стоковый раствор из пяти миллиграммов на миллилитр.

Затем процедить стерилизованный раствор. За два с половиной часа до окончания трехдневного инкубационного периода добавьте по 25 микролитров раствора МТТ в каждую лунку клеток и завершите инкубационный период. Приготовьте 50%-ный диметилформамид NN или ДМФ, смешав 250 миллилитров ДМФА с 250 миллилитрами деионизированной воды.

Подготовьте буфер для извлечения MTT следующим образом. Заложите 100 грамм SDS в бутылку объемом 500 миллилитров и добавьте 300 миллилитров 50% DMF. Нагрейте на слабом огне, чтобы паспорт безопасности растворился.

Добавьте 10 миллилитров чистой уксусной кислоты и 12,5 миллилитров одного моляра соляной кислоты. Затем используйте 50% DMF, чтобы наполнить бутылку до отметки 500 миллилитров. По окончании периода лечения добавьте в каждую лунку по 100 микролитров экстракционного буфера.

Инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% углекислого газа, в течение ночи. На следующий день считайте поглощение на 570 нанометрах. Для проведения анализа на резазурин выращивают M.tuberculosis в 7H9 ADST до средней фазы.

Разбавьте культуру 7H9 ADST до OD600 0,01. Используйте 7H9 ADST для разбавления соединений до концентрации, в два раза превышающей исследуемую концентрацию. И внесите по 100 микролитров каждого разведенного состава в каждую лунку на 96 луночный планшет.

В каждую лунку перелейте по 100 микролитров разведенной бактериальной суспензии. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе в течение пяти дней. Растворите 10 миллиграмм резазурина в 100 миллилитрах деионизированной воды.

И процеживаем раствор. Добавьте в лунки 30 микролитров раствора резазурина. Затем инкубируйте клетки в течение 48 часов.

Рост бактерий проявляется в преобразовании цвета из голубого в розовый. Провести количественный анализ согласно текстовому протоколу. На этой диаграмме рассеяния показаны исходные данные люминесценции, измеренные в единицах относительной люминесценции для лечения различных концентраций рифампицина на клетках M.tuberculosis и THP1.

На этом графике показано процентное снижение и люминесценция в обработанных скважинах по сравнению с необработанными скважинами. Рифампицин способен восстанавливать 99,9% относительных световых единиц, или RLU от внутриклеточного M.tuberculosis в концентрации 0,1 мкг на миллилитр. Аналогично ранее опубликованным результатам, полученным из КОЕ.

На этом рисунке проиллюстрирована цитотоксичность, вызванная повышением концентраций G1-1H, используемых в анализе МТТ. Концентрации 10 и трех микромоляров явно ниже порогового значения IC 50. На этом рисунке показано влияние различных концентраций антибиотика апрамицина на конверсию резазурина при M.tuberculosis.

Содержание MIC90 в бульоне составляло от 2,5 до 5 микрограммов на миллилитр. Это немного выше ранее опубликованного значения в 1,5 микрограмма на миллилитр. Но он все еще находится в пределах допустимого диапазона.

Как показано здесь, испарение становится важным для всех экспериментов с длительным временем инкубации. Поэтому необходимо позаботиться о том, чтобы инкубаторы были хорошо увлажнены, чтобы избежать несоответствий. После освоения эта техника может обеспечить надежные внутриклеточные данные всего за четыре дня.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости осторожного обращения с клетками THP1 и последовательности в отношении пипетирования, если вы пытаетесь провести его без автоматизации. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как скрининг с высоким содержанием, чтобы определить, являются ли пораженные соединения бактериостатическими или бактерицидными. После его разработки этот протокол проложил путь исследователям в области разработки лекарств от туберкулеза для быстрой оценки эффективности соединений против МБТ внутри макрофагов человека.

Не забывайте, что работа с микробактериями туберкулеза опасна. Используйте меры предосторожности и надлежащее оборудование при работе с этим микроорганизмом.