Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных

Общая цель данного протокола — обеспечить многомерную оценку влияния соединений на выживаемость M.tuberculosis внутри макрофагов человека. В основе данного метода лежит анализ эффективности на базе люциферазы. В сочетании с определением цитотоксичности и МПК данный анализ может предоставить полезную информацию для модификации соединений-хитов при разработке противотуберкулезных препаратов.

Основным преимуществом нашего метода является экономия времени и трудозатрат. Он предполагает замену анализа КОЕ (колониеобразующих единиц) на анализ на основе люциферазы. Как правило, лица, впервые осваивающие данную методику, сталкиваются с проблемой воспроизводимости результатов при ручном дозировании в отличие от автоматизированного процесса.

Решающее значение имеет единообразие техники пипетирования. Культивируйте клетки THP1 в среде RPMI в полной среде, поддерживая плотность клеток от 0,2 до одного миллиона клеток на мл среды между пассажами.

Используйте спектрофотометр для измерения OD600 активно растущей бактериальной суспензии. Затем рассчитайте плотность бактерий, используя коэффициент пересчета: 0,1 OD600 соответствует 3 × 10⁷ бактерий на миллилитр. Пипетируйте необходимое количество бактерий для обеспечения MOI 10:1 в новую центрифужную пробирку.

Затем осадите бактерии центрифугированием при 3 000 ×g в течение 10 минут. Для опсонизации бактерий добавьте 50 µL человеческой сыворотки к 450 µL среды RPMI 1640 и используйте полученную смесь для ресуспендирования бактериального осадка до плотности 1 × 10⁸ бактерий на 500 µL среды. Инкубируйте смесь при 37 °C в течение 30 минут.

Затем с помощью гемоцитометра и инвертированного микроскопа определите плотность культуры клеток THP1. После этого в стерильных центрифужных пробирках осадите клетки при 100 ×g при 37 °C в течение 10 минут. Оспирируйте супернатант и ресуспендируйте клетки в полной среде RPMI до плотности 1 × 10⁶ клеток/мл.

Добавьте PMA до конечной концентрации 40 nanograms per milliliter. Это смесь для дифференцировки. Объедините опсонизированные M.tuberculosis со смесью для дифференцировки THP1 при MOI 10:1.

Затем разлейте конечную смесь по лункам 96-луночного белого планшета с плоским дном по 100 µL на лунку. Оставьте культуру для дифференцировки и инфицирования в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 на ночь. На следующий день дважды промойте лунки, используя по 100 µL среды RPMI.

Затем добавьте соединения, разведенные до требуемых концентраций, и RPMI в полной среде. Инкубируйте планшеты в течение трех дней. При использовании многоканальных дозаторов помните о необходимости медленного и плавного нажатия на поршень; всегда помещайте наконечники дозатора в одну и ту же точку внутри каждой лунки, чтобы минимизировать воздействие на клетки THP1.

После инкубации аспирируйте среду из лунок и добавьте в каждую лунку 50 µL реагента для определения люциферазы. Затем загерметизируйте планшеты прозрачными адгезивными пленками. Инкубируйте планшеты при 22 °C в течение пяти минут, после чего с помощью люминометра получите показания с экспозицией одну секунду на лунку.

Для дифференцировки клеток THP1, после приготовления смеси для дифференцировки, как было показано ранее в этом видео, внесите по 100 µL смеси в каждую лунку прозрачного 96-луночного планшета с клетками. Инкубируйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% carbon dioxide в течение ночи. На следующий день аспирируйте среду из лунок и дважды промойте их с помощью RPMI 1640.

Добавьте в лунки по 100 µL соединений, разведенных в неполной среде RPMI. Затем инкубируйте клетки в течение трех дней. Растворите 0,5 g MTT в 100 mL PBS для приготовления стокового раствора с концентрацией 5 mg/mL.

Затем стерилизуйте раствор путем фильтрации. За два с половиной часа до окончания трехдневного периода инкубации добавьте 25 µL раствора MTT в каждую лунку с клетками и доведите инкубацию до конца. Приготовьте 50% раствор диметилформамида (DMF), смешав 250 milliliters DMF с 250 milliliters деионизированной воды.

Приготовьте буфер для экстракции МТТ следующим образом. Поместите 100 г SDS в бутыль объемом 500 мл и добавьте 300 мл 50% DMF. Слегка нагрейте смесь, чтобы SDS полностью растворился.

Добавьте 10 milliliters чистой уксусной кислоты и 12.5 milliliters одного молярного раствора соляной кислоты. Затем долейте в бутыль 50%DMF до отметки 500 milliliter. По окончании периода обработки добавьте по 100 microliters экстракционного буфера в каждую лунку.

Инкубируйте смесь при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO2 в течение ночи. На следующий день измерьте оптическую плотность при 570 нм. Для проведения резазуринового теста вырастите M.tuberculosis в среде 7H9 ADST до среднелогарифмической фазы.

Разведите культуру средой 7H9 ADST до OD600, равной 0,01. Используйте среду 7H9 ADST для разведения соединений до концентрации, в два раза превышающей рабочую концентрацию для тестирования. Расположите по 100 microliters каждого разведенного соединения в каждую лунку прозрачного 96-луночного планшета.

Перенесите по 100 microliters разведенной бактериальной суспензии в каждую лунку. Инкубируйте планшеты при 37 degrees Celsius в увлажненном инкубаторе в течение пяти дней. Растворите 10 milligrams резазурина в 100 milliliters деионизированной воды.

Затем стерилизуйте раствор путем фильтрации. Добавьте в лунки по 30 µL раствора резазурина. После этого инкубируйте клетки в течение 48 часов.

Бактериальный рост определяется по изменению цвета с синего на розовый. Проведите количественный анализ в соответствии с текстовым протоколом. На данной диаграмме рассеяния представлены необработанные данные люминесценции, измеренные в относительных единицах люминесценции, при воздействии различных концентраций рифампицина на M.tuberculosis и клетки THP1.

На данном графике показаны процент снижения и люминесценция в обработанных лунках по сравнению с необработанными лунками. Рифампицин способен снизить относительные единицы света (RLU) от внутриклеточных M.tuberculosis на 99.9% при концентрации 0.1 µg/mL. Это соответствует ранее опубликованным результатам, полученным методом подсчета КОЕ.

На данном рисунке представлена цитотоксичность, вызванная увеличением концентраций G1-1H, использованных в МТТ-тесте. Концентрации 10 и 3 мкМ явно находятся ниже порогового значения IC 50. На этом рисунке показано влияние различных концентраций антибиотика апрамицина на конверсию резазурина клетками M.tuberculosis.

Значение МПК90 в бульоне составило от 2,5 до пяти µg/mL. Это несколько выше ранее опубликованного значения 1,5 µg/mL, однако данный показатель все еще находится в пределах допустимого диапазона.

Как показано здесь, испарение становится значимым фактором для всех экспериментов с длительным временем инкубации. Поэтому необходимо следить за тем, чтобы в инкубаторах поддерживался достаточный уровень влажности во избежание несоответствий в результатах. После освоения данная методика позволяет получить надежные данные о внутриклеточных процессах всего за четыре дня.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости бережного обращения с клетками THP1, а также о соблюдении единообразия при пипетировании, если работа проводится без использования автоматизации. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как высокопроизводительный скрининг, чтобы определить, являются ли активные соединения бактериостатическими или бактерицидными. После своей разработки данный протокол открыл исследователям в области поиска противотуберкулезных препаратов возможность быстро оценивать эффективность соединений против MTB внутри макрофагов человека.

Не забывайте, что работа с microbacterium tuberculosis опасна. При обращении с этим микроорганизмом соблюдайте меры предосторожности и используйте соответствующее оборудование.