Name: Кинетика синтеза Отставание-нити ДНК In Vitro С помощью бактериофага Т7 белков репликации (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Изучите кинетику синтеза отставающей цепи ДНК in vitro с использованием белков репликации бактериофага T7. Этот метод позволяет исследовать образование праймеров и синтез фрагментов Оказаки.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы благодарим сотрудников лаборатории C.C.R. за комментарии и С. Московица за подготовку рисунка. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения F32GM101761 (A.J.H.) и GM54397 (C.C.R.).

<ol><li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).</li>
<li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motors%2C+switches%2C+and+contacts+in+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li>
<li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li>
<li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li>
<li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li>
<li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li>
<li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li>
<li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li>
<li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li>
<li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li>
<li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658(2013).</li>
<li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+enzyme+kinetic+analysis%2C+1913%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li>
<li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).</li>
<li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Самым важным фактором при проведении этих экспериментов является наличие высокой активности очищенного фермента. В ходе работы с GP4, например, мы обнаружили, что хранение очищенного фермента в буфере (20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ), содержащей 50% глицерина при температуре от -20 &amp; deg; С приводит к уменьшению удельная активность препарата в течение нескольких месяцев. Поэтому мы теперь флэш-замораживающие небольшие аликвоты очищенного GP4 в 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ...

Репликация ДНК является сохраняющимся особенностью всех клеточной жизни. В то время как идентичность и количество компонентов репликации варьироваться в широких пределах, общие механизмы являются общими для эволюции 1. Здесь мы опишем гель на основе, разрывные кинетических экспериментов, с использованием радиоактивных субстратов, направленных на понимание кинетики отстающей нити синтеза ДНК в пробирке компонентами Т7 replisome. Механизм репликации бактериофага Т7 является очень простой, состоящий только из четырех белков (ДНК - полимеразы, GP5, а его коэффициент процессивности, E.coli тиоредоксин, бифункциональные праймаза-хеликаза GP4 и связывания одноцепочечной ДНК белка, GP2. 5) 2. Эта особенность делает его привлекательным модель системы для изучения биохимических консервативных механизмов, участвующих в репликации ДНК. Особый акцент делается на формирование рибонуклеотид праймеров Т7 ДНК праймаза, а Criticaл шаг в инициации синтеза ДНК. Кроме того, можно также рассмотреть использование этих праймеров ДНК-полимеразы Т7 или другие белки репликации путем включения их в реакционной смеси. Т7 праймаза-хеликаза, gp4, катализирует образование праймеров для синтеза ДНК в специфических последовательностей ДНК, называемых праймаза сайты узнавания, или ССБ (5&#39;-GTC-3 &#39;). Цитозин в ССБ маскировочная, важно для распознавания сайта, но не копируется в продукт 3. Первым шагом в синтезе праймера GP4 предполагает формирование динуклеотиде pppAC, который затем распространяется на тример, и в конечном итоге к функциональным тетрануклеотидных праймеров pppACCC, pppACCA или pppACAC в зависимости от последовательности в шаблоне 4. Эти праймеры могут быть использованы с помощью ДНК - полимеразы Т7 для инициации синтеза ДНК, который также является процессом gp4 при содействии 5, 6. В связи с этим, праймазадомен стабилизирует чрезвычайно короткие tetraribonucleotides с шаблоном, предотвращая их диссоциации, входит в зацепление ДНК - полимеразы в форме , способствующей обеспечению праймера / шаблон в полимераза активного сайта 7. Эти шаги (синтез РНК праймера, праймера для передачи обслуживания полимеразы и расширения) повторяются в нескольких циклах, чтобы повторить отстающей нити и должны быть согласованы с репликацией ведущей нити. Анализы, описанные здесь, обладают высокой чувствительностью и могут быть выполнены в умеренном сроки. Тем не менее, они являются относительно низкими пропускной способности и большое внимание должно быть осуществлено в использовании и утилизации радиоактивных материалов. В зависимости от скорости, при которой реакция протекает, можно было бы возможность использовать более быстрого резкого охлаждения инструмента для достижения пробы на временных масштабах, поддающихся для содержательного анализа времени реакции курсов в любом неуклонный или предварительно установившемся состоянии. В последнее время мы использовали анализы описанные здесь, чтобы обеспечить evidencе важности высвобождения праймера из праймаза домена GP4 в инициации Окадзаки фрагментов. Кроме того, мы нашли доказательства регуляторной роли Т7 одноцепочечной ДНК - связывающего белка, gp2.5, в содействии эффективному формированию и использованию 8 праймера.

<table><tbody><tr><td>Трис предустановленные кристаллы pH 7,5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Трис основание</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-глутаминовая кислота моногидрат калийной соли</td><td>SIGMA</td><td>G1501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Гексагидрат хлорида магния</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-дитиотреитол</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Додецилсульфат натрия</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr> <tr><td>(этиленединитрило) Тетрауксусная кислота, динатриевая соль, дигидрат</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&alpha;-32P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>радиоактивный, принимать защитные меры[</td></tr><tr><td>&gamma;-32P] АТФ</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>радиоактивный, принимать защитные меры</td></tr><tr><td>100 мМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>четыре dNTP входит в состав набора</td></tr><tr><td>100 мМ АТФ и CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>входит в состав набора</td></tr><tr><td>NTP ssDNA конструктирует</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>custom sequences&nbsp;</td></tr><tr><td>Метанол</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>формамид</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>бромофенол синий</td><td>SIGMA</td><td>B8026&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Сайлен Ксианол&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>акриламид</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>N,N&prime; -метиленбисакриламид</td><td>SIGMA</td><td>M7279&nbsp;</td><td>токсичный</td></tr><tr><td>Мочевина</td><td>Бостон Биопродукты</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Борная кислота</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Инструмент для быстрого тушения&nbsp;</td><td>Корпорация «Кинтек»</td><td>РКФ-3&nбсп;</td><td></td></tr><tr><td>Кинтек Эксплорер</td><td>Kintek Corp.</td><td>Н/Д</td><td></td></tr><tr><td>Калейдаграф&nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>Н/Д</td><td></td></tr></tbody></table>

Кинетика синтеза Отставание-нити ДНК<em&gt; in vitro</em&gt; С помощью бактериофага Т7 белков репликации

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Здесь мы предоставляем протоколы для кинетического исследования синтеза ДНК с отстающей цепью in vitro с помощью репликационных белков бактериофага T7. Репликисома Т7 является одной из простейших известных систем репликации, состоящей всего из четырех белков, что является привлекательной особенностью для биохимических экспериментов. Особый акцент сделан на синтезе рибонуклеотидных праймеров по геликазе примазы Т7, которые используются ДНК-полимеразой для инициирования синтеза ДНК. Поскольку механизмы репликации ДНК сохраняются на протяжении всей эволюции, эти протоколы должны быть применимы или полезны в качестве концептуального трамплина для исследователей, использующих другие модельные системы. Описанные здесь протоколы являются высокочувствительными, и опытный исследователь может провести эти эксперименты и получить данные для анализа примерно за один день. Единственное специализированное оборудование, которое требуется, — это инструмент с быстрым потоком, но это оборудование относительно распространено и доступно из различных коммерческих источников. Основными недостатками этих анализов, однако, являются использование радиоактивности и относительно низкая пропускная способность.

Результаты , показанные на рисунке 1А , были получены , как описано в шаге 1 протокола, т.е. вручную путем выборки реакции синтеза праймера , катализируемый GP4 в условиях множественного оборота. Здесь целый ряд продуктов , после того, как гель - электрофореза можно наблюдать с помощью CTP , меченного 32 P в a-положении в реакциях синтеза праймера (Рис . 1А) Меченый предшественник, CTP, показывает сам...

Мы описываем чувствительные прерывистые анализы на основе геля для изучения кинетики инициации запаздывающей нити с использованием репликационных белков бактериофага T7.

Кинетика синтеза Отставание-нити ДНК<em&gt; In Vitro</em&gt; С помощью бактериофага Т7 белков репликации

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Общая цель данной процедуры заключается в изучении кинетики синтеза ДНК инициирующего и запаздывающего This-цепей. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области репликации ДНК, такие как механизмы формирования праймеров ДНК-праймазой, их перенос на ДНК-полимеразу и последующее использование. Основным преимуществом данной методики является возможность идентификации ключевых этапов синтеза фрагментов Окадзаки.Поскольку в данном эксперименте используются радиоактивные материалы, необходимо соблюдать все требования учреждения по безопасному обращению с радиоактивными материалами и их утилизации. Сначала внесите по 2 µL буфера с красителем формамидом в восемь полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл, что соответствует количеству анализируемых временных точек. Затем приготовьте смесь объемом 20 µL, состоящую из буфера, ATP, CTP, CTP, меченного по альфа-фосфатной группе P32, одноцепочечного матричного ДНК и белка gene four, или праймазы-хеликазы GP four.Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. По истечении пяти минут с помощью дозатора отберите 2 µL смеси и смешайте ее с 2 µL буфера с красителем формамидом в одной из заранее подготовленных пробирок объемом 1.5 mL. Это будет контролем отсутствия реакции.Добавьте 2 µL 0,1 M хлорида магния в реакционную смесь и немедленно запустите таймер. С интервалом в 10 секунд вручную отбирайте пробы реакционной смеси объемом 2 µL и смешивайте их с красителем на основе формамида в пробирках объемом 1,5 мл. После сбора всех временных точек прогрейте образцы в термоблоке при 95 °C в течение пяти минут.Нанесите аликвоты образцов на денатурирующий гель для электрофореза. Начните выполнение данной процедуры с приготовления реакционных смесей. Приготовьте 400 microliters раствора А, содержащего буфер, гексамер GP four, одноцепочечный матричный DNA, dNTPs, ATP и CTP, меченный по альфа-фосфатной группе P32.Приготовьте 400 µL раствора B, содержащего 1X буфер и 20 мM хлорида магния. Затем подготовьте установку для быстрого прекращения реакции (rapid quench flow). Включите прибор и после появления главного меню введите цифру 7 на клавиатуре прибора, чтобы переместить привод шприца в исходное положение.Откройте позицию шприца с буфером для загрузки. Заполните шприц C гасящим раствором, затем с помощью шприца объемом 10 миллилитров заполните резервуары прибора A и B буфером. Удалите пузырьки воздуха, несколько раз перемещая поршни шприцев вперед и назад.Переведите ручки в положение для запуска. Используйте тип два для регулировки положения штанги привода шприца. Нажмите кнопку регулировки вниз, чтобы опустить шприц до тех пор, пока буфер не выйдет из выходной петли.Нажмите клавишу escape, чтобы вернуться в главное меню. Для промывки трубок подключите выходную линию к вакуумному насосу. Переведите ручки образцов в положение «промывка» (flush).Поверните ручки в горизонтальное положение, чтобы закрыть шприц с буфером. Включите вакуум, погрузите две промывочные петли в воду на 10 секунд, а затем в метанол на 10 секунд. Просушите петли, всасывая воздух в течение примерно 15 секунд или до полного высыхания.Для загрузки образцов переведите рукоятку переключения образцов в положение load. Поместите раствор A в шприц объемом 1 мл, вставьте шприц в один из портов загрузки образцов; аналогично поместите раствор B в противоположный порт загрузки образцов. Начните сбор временных точек, введя цифру 1 в главном меню для запуска режима quench flow.Введите время реакции и нажмите Enter. На дисплее отобразится номер контура реакции, который необходимо использовать. Переключитесь на требуемый контур реакции.После промывки трубки, как было продемонстрировано ранее, поверните ручки подачи образца в положение «load» (загрузка). Заполните петли для образцов реакционными смесями до уровня чуть за пределами центральной смесительной камеры. Поверните все ручки в положение «fire» (запуск) и убедитесь, что все ручки установлены в правильное положение.Поместите пробирку объемом 1,5 мл в конец выходной петли. Нажмите «Пуск» (Go) для запуска реакции. После повторения процедуры промывки трубок снова заполните шприцы с буфером А и В до тех пор, пока они не упрутся в привод шприцев с буфером.Повторите этапы проведения реакции для каждой необходимой временной точки с одним исключением: не вводите раствор B при остановке реакции для контрольного образца в нулевой временной точке. После завершения сбора образцов нажмите клавишу escape, чтобы вернуться в главное меню. Нажмите семь, чтобы вернуть привод шприца с буфером в исходное положение.Начните очистку прибора с извлечения шприцев с реакционной смесью, затем поверните ручку загрузки образцов в положение «load» (загрузка). В условиях вакуума промойте каждую петлю для образца по 10 milliliters гидроксида натрия, фосфорной кислоты и метанола. Нажмите на поршни всех трех шприцев, чтобы извлечь реакционный буфер и буфер для гашения реакции.Промойте шприцы пятью миллилитрами воды не менее двух раз. Снова наполните шприцы пятью миллилитрами воды, переведите ручки в положение fire, включите вакуум и с помощью команды на клавиатуре опустите драйвер, чтобы удалить воду. Промойте трубки, как было показано ранее.Наконец, выключите прибор для быстрого гашения потока. Затем образцы анализируют согласно текстовому протоколу. Данные результаты были получены путем ручного отбора проб из реакции синтеза праймера, катализируемой GP four в условиях многократного оборота.Меченый предшественник CTP обладает наибольшей подвижностью и мигрирует к нижней части геля, за ним следуют более медленно мигрирующие фракции, соответствующие красителю и тетрарибонуклеотидам, синтезированным GP four. В зависимости от продолжительности инкубации и контекста последовательности матрицы могут наблюдаться дополнительные меченые продукты, соответствующие более длинным олигомерам. При использовании прибора для быстрого гашения с целью изучения реакции, катализируемой GP four, в временных масштабах от нескольких секунд до нескольких мс, становится очевидным, что накопление праймера происходит нелинейно и имеет двухфазный профиль, обозначенный сплошной линией.Это свидетельствует о том, что образование продукта происходит быстро, а его высвобождение является лимитирующей стадией в стационарном состоянии. Пунктирная линия представляет собой гипотетическую кривую прогресса, которая получилась бы, если бы синтез праймера GP four не сопровождался вспышкой в предстационарном состоянии. Эксперимент по синтезу праймера в режиме одного оборота дает информацию об образовании и распаде промежуточных соединений в процессе превращения субстрата в продукт.На изображении геля показана кинетика образования тетрамера. На графике представлена зависимость образования промежуточных продуктов от времени. При должном исполнении и наличии соответствующего навыка данная методика может быть выполнена за 90 минут.Не забывайте, что работа с радиоактивными реагентами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование надлежащего экранирования.

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

JoVE Journal

Genetics

Генетика

Этот протокол демонстрирует простой одной молекулы флуоресцентной микроскопии технику для визуализации репликации ДНК отдельных replisomes в реальном времени.

Визуализация одиночных молекул ДНК репликации с помощью флуоресцентной микроскопии

Мы опишем метод для наблюдения реального времени репликации отдельных молекул ДНК посредничестве белков системы репликации бактериофагов.

Прямое наблюдение Ферменты Репликация ДНК Использование одиночных молекул ДНК Растяжка Пробирной

Судьба replisome после столкновения с лобовым РНК-полимераза (РНКП), неизвестно. Мы считаем, что replisome киосков при столкновении с передней частью РНКП, но возобновляется удлинения после перемещения РНКП с ДНК. MfD способствует репликации перезагрузки, облегчая перемещение РНКП после столкновения.

Прямое возобновление репликации Форк блокировалось Головой об РНК-полимеразы

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Новое поколение свободных клеток транскрипции перевод платформ был инженерии построить биохимических систем в vitro через исполнение цепи гена. В этой статье мы опишем, как бактериофагов, таких как MS2, ΦΧ174 и Т7, синтезируются из их геном, с использованием всех в свободных клеток E. coli TXTL системы.

Синтез инфекционных бактериофагов в E. coli-на основе свободных клеток выражение системы

Воспроизводимость, точность и время эффективный количественный PCR (ПЦР) метод для перечисления бактериофага Т7 описано здесь. Протокол четко описывает подготовка геномной ДНК фага, подготовка реакции PCR, Велоспорт условия ПЦР и ПЦР анализа данных.

Количественная ПЦР бактериофага Т7 от Biopanning

В этой рукописи мы описываем протокол для функционального изучения транскрипции и ингибирующей активности антибактериальных агентов, нацеленных на бактериальную транскрипцию.

In Vitro Транскрипция Анализы и их применение в Drug Discovery

РНК-белковые взаимодействия лежат в основе многих клеточных процессов. В этой статье мы описываем метод in vivo для выделения специфической РНК и идентификации новых белков, которые с ней связаны. Это может пролить новый свет на то, как РНК регулируются в клетке.

Novel Выделение РНК-связывающих белков Стремительное Методология

Оогенез дрозофилы продолжает оставаться исключительно полезным в изучении митохондриальной пролиферации и наследования. В данной рукописи подробно описан протокол, используемый для мечения реплицирующейся митохондриальной ДНК (мтДНК) в яичниках взрослых особей дрозофилы 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU), что облегчает раскрытие механизмов, связанных с митохондриальным наследованием, которые ранее были предметом споров.

В Ситу маркировки репликации митохондриальной ДНК в Drosophila взрослых яичников с помощью EDU Окрашивание

Мы описываем здесь относительно быстрый и простой подход к картированию времени репликации всего генома млекопитающих, от выделения клеток до базового анализа результатов секвенирования. В соответствии с протоколом будет предоставлена геномная карта репрезентативной программы репликации.

Генома Определение МЛЕКОПИТАЮЩИХ репликации ДНК с помощью Timing Content измерения

Изучите кинетику синтеза отставающей цепи ДНК in vitro с использованием белков репликации бактериофага T7. Этот метод позволяет исследовать образование праймеров и синтез фрагментов Оказаки.

Кинетика синтеза Отставание-нити ДНК

Больше видео