Стимуляция воспалительной реакции в первичной культурах гепатоцитов мышей

Общая цель данной процедуры — успешное выделение функциональных гепатоцитов мыши для изучения экспрессии и секреции воспалительных цитокинов, таких как CRP и IL6, в ответ на медиаторы острофазового ответа печени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о функции гепатоцитов и вкладе печеночных цитокинов в поддержание длительного воспалительного процесса, характерного для хронической болезни почек. Основным преимуществом данной методики является то, что она предоставляет надежный инструмент для простого, быстрого и воспроизводимого анализа метаболомики и воспаления в печени, а также анализа ответа на лекарственные препараты.

Для начала предварительно нагрейте среду для перфузии печени и среду для переваривания печени на водяной бане при 37 °C. Подготовьте перфузионный насос, как показано здесь. Затем с помощью среды для перфузии печени осторожно заполните систему трубок насоса.

Старайтесь избегать появления пузырьков воздуха в системе. Подготовьте стереотаксический микроскоп для проведения процедуры перфузии. Затем, после анестезии мыши-донора в соответствии с текстовым протоколом, поместите анестезированное животное на абсорбирующую салфетку.

Используйте адгезивную ленту для фиксации конечностей мыши. Затем выбрейте шерсть на животе мыши и продезинфицируйте эту область. После этого с помощью хирургических ножниц с острым и тупым концами выполните вентральную лапаротомию от лобковой кости до краниального края печени.

Произведите разрез брюшной стенки с обеих сторон в положении каудально относительно диафрагмы. Обнажите нижнюю полую вену (НПВ), осторожно отодвигая кишечник в правую сторону с помощью стерильных ватных тампонов. С помощью тонких хирургических ножниц с острыми концами сделайте латеральные надрезы через супрагепатическую часть диафрагмы и вскройте грудную полость.

Затем с помощью хирургического шелка 5-0 перевяжите грудную нижнюю полую вену. С помощью катетера с защитным экраном канюлируйте инфраренальный отдел нижней полой вены. Подключите перфузионный насос и начните перфузию печени.

При правильном выполнении печень должна начать немедленно бледнеть и набухать. Затем с помощью тонких хирургических ножниц пересеките воротную вену, обеспечив надлежащий отток крови и перфузионной среды. После перфузии печени примерно 30 milliliters перфузионной среды для печени остановите перфузионный насос.

Переключитесь на среду для переваривания печени и снова запустите насос. По завершении перфузии извлеките канюлю. Осторожно обнажите центральную область печени и найдите соединительную ткань, связывающую доли печени.

Захватите центральные соединительные волокна и осторожно препарируйте все ткани, удерживающие печень на месте. Затем аккуратно извлеките печень. Немедленно перенесите орган в полипропиленовую коническую пробирку объемом 50 milliliter, содержащую 15 milliliters среды для переваривания печени.

Работая в ламинарном шкафу для культур клеток, перенесите печень из конической полипропиленовой пробирки объемом 50 мл в стерильную чашку для культивирования тканей. С помощью стерильного пинцета осторожно разделите четыре доли печени. При правильном выполнении среды для переваривания должно стать мутным из-за выделения гепатоцитов из печени.

Используя стерильный наконечник для пипетки объемом 25 мл, профильтруйте мутную среду для переваривания через нейлоновый фильтр для клеток с размером пор 70 мкм в новый конический полипропиленовый центрифужный флакон объемом 50 мл, чтобы удалить непереваренные частицы ткани и клеточный дебрис. Центрифугируйте объединенный фильтрат при 50 ×g при температуре 4 °C в течение двух минут, затем аспирируйте супернатант, содержащий избыточный клеточный дебрис, и используйте 25 мл холодной среды 1X William's Medium E для осторожного ресуспендирования клеток. После трехкратного повторения фильтрации и промывки гепатоцитов аспирируйте супернатант для удаления избыточного клеточного дебриса.

Ресуспендируйте клетки в 25 миллилитрах подогретой среды William's Medium E (1X), содержащей добавки для размораживания и посева первичных гепатоцитов, и профильтруйте суспензию через новый нейлоновый фильтр для клеток с размером пор 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. После подсчета клеток посейте их в 2 миллилитрах среды William's Medium E, содержащей добавки для размораживания и посева первичных гепатоцитов, в шестилуночный планшет для культивирования клеток с коллагеновым покрытием. После двухкратной замены среды для последующего голодания клеток обработайте их в безсывороточной среде PBS в качестве контроля, 25 нанограммами на миллилитр FGF23, 100 микрограммами на миллилитр LPS или 50 нанограммами на миллилитр IL6.

Инкубируйте культуры в течение 24 часов. После выделения РНК с помощью набора со спин-колонками согласно инструкциям производителя, добавьте 200 нанограмм выделенной РНК в ПЦР-пробирку. Затем добавьте в пробирку 14 микролитров воды, не содержащей эндонуклеазы, и четыре микролитра обратной транскриптазы.

Поместите ПЦР-пробирку в амплификатор и запустите следующую программу обратной транскрипции для синтеза кДНК. Для проведения количественной ПЦР смешайте следующие компоненты мастер-микса для кПЦР в пробирке на льду. Перемешайте мастер-микс на вортексе.

Затем распределите по 9 µL раствора в каждую лунку планшета на 96 лунок. Осторожно добавьте по 1 µL кДНК в каждую лунку, подготовив по три лунки для каждого образца. В завершение проведите анализ образцов в приборе для ПЦР в реальном времени и проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом.

Здесь представлено репрезентативное изображение первичных изолированных и культивируемых клеток, полученное с помощью световой микроскопии. Иммуноцитохимический анализ показывает, что изолированные гепатоциты экспрессируют высокий уровень альбумина, а также рецептора фактора роста фибробластов 4. В данном эксперименте первичные изолированные гепатоциты обрабатывали FGF23, LPS или IL6 в течение 24 часов, после чего уровни мРНК CRP и IL6 анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени.

LPS, IL6 и FGF23 значительно повысили экспрессию CRP и IL6. Как показано здесь, супернатанты культур изолированных первичных гепатоцитов были проанализированы методом ELISA для определения уровней CRP. Как было продемонстрировано с помощью QPCR-анализа, обработка LPS, IL6 и FGF23 значительно повысила уровни CRP в супернатантах клеток по сравнению с клетками, обработанными PBS.

После освоения эта методика может быть выполнена всего за несколько часов при условии правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости поддержания стерильных условий. Поскольку работа ведется с первичной культурой, минимизация риска возможного загрязнения имеет первостепенное значение для достижения оптимальных результатов.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как успешно выделить гепатоциты мыши для изучения различных функций гепатоцитов, таких как экспрессия и секреция печеночных цитокинов.