Анализ клеточной поверхности адгезии Ремоделирование в ответ на механическое напряжение с помощью магнитных шариков

Общая цель этого эксперимента заключается в изучении биохимических путей, которые активируются в ответ на напряжение с использованием покрытых лигандом магнитных микрогранул и принудительного воздействия на рецепторы адгезии. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области механических транзакций, например, как механическое напряжение от экспресс-хелометрики направляет их от дифференцировки или как податливость тканей стимулирует их трансформацию. Основное преимущество этого метода заключается в том, что многие клетки могут быть стимулированы для химического анализа с помощью гранул для натяжения определенного подмножества рецепторов адгезии.

Для начала тщательно восстановите суспендию суперпарамагнитных тозилактивированных шариков в оригинальном флаконе путем вортексирования в течение не менее 30 секунд. Аликвотировать 40 микролитров ресуспендированных суперпарамагнитных шариков в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую один миллилитр 0,1 молярного фосфата натрия pH 7,4. Затем поместите трубку на магнитную разделительную стойку, чтобы отделить магнитные шарики от раствора.

Выбросьте надосадочную жидкость и снимите трубку со стенда для магнитной сепарации. Ресуспендируйте шарики в одном миллилитре 0,1 моляра фосфата натрия pH 7,4. Промыв бусины дважды, снова суспендируйте бусины в одном миллилитре того же буфера.

Затем соедините 100 микрограммов бычьего фибронектина или любого другого лиганда рецептора адгезии клеток с шариками и вихрем. Повторите этот шаг, заменив лиганд на BSA, поли-D-лизин или апотрансферрин для отрицательного контроля. Инкубируйте шарики с раствором, содержащим лиганд, в течение 12-24 часов при температуре 37 градусов Цельсия на роторе.

Если агрегаты шариков появились уже после того, как реакция произошла, облучайте ультразвуком не более 10 – 20 секунд. Далее изолируйте шарики с помощью магнитной разделительной стойки и отсасывайте оставшийся раствор. Затем добавьте один миллилитр раствора PBS с добавлением 0,2%-ного белка бычьей сыворотки.

Инкубировать в течение часа на роторе при температуре 37 градусов Цельсия. С помощью магнита промойте бусины одним миллилитром раствора PBS с добавлением 0,2%-ного бычьего сывороточного белка два раза. Перед этим суспендировать их в одном миллилитре того же буфера.

Обрабатывайте бусины, если агрегаты появляются, не более 20 – 30 секунд. Приступайте к анализу клеток или храните шарики при температуре четыре градуса Цельсия до одного месяца. Культивируйте адгезивные клетки на чашке для культуры тканей объемом 60 мл в соответствующей питательной среде до достижения 80% конфлюенции.

После гранулирования гранул, покрытых лигандом, Ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре раствора PBS с добавлением 0,2% бычьего сывороточного белка. Добавьте 100 микролитров раствора гранул, покрытых лигандом, к пяти миллилитрам теплой питательной среды и вортекса. Далее отсадите среду в посуду для культуры объемом 60 миллилитров и добавьте пять миллилитров теплой питательной среды, дополненной бусинами.

Инкубируйте суспензию в течение 20 минут в условиях клеточной культуры, чтобы гранулы оседали и прилипли к клеткам. Очень важно не превышать 20 минут, так как бусины могут быть интернализованы фагоцитозом. Затем рассмотрите бусины под световым микроскопом с помощью объектива 10X или 20X.

Проверьте адгезию валиков, слегка встряхивая тарелку, чтобы различить прикрепленные и плавающие бусины. Поместите круглый 38-миллиметровый неодимовый магнит на верхнюю поверхность обычной 60-миллиметровой крышки чашки для культивирования и удерживайте его на месте с помощью двух меньших 13-миллиметровых неодимовых магнитов, расположенных на нижней поверхности крышки. Инкубируйте клетки, подвергшиеся напряжению, в течение желаемых временных точек и условий культивирования клеток.

Поменяйте обычную крышку для тарелки на крышку с магнитом. Так как магниты очень мощные, манипулируйте ими осторожно. После обработки поставьте блюдо на лед и тщательно отсасывайте всю среду из блюда.

Добавьте 300 микролитров буфера для лизиса клеток и инкубируйте 10 минут на льду. Затем соберите лизат с помощью скребка для клеток и переложите его в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Гранулируйте магнитные шарики с помощью стенда для магнитной сепарации и перенесите весь лизат клеток в новую, предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Удалите 15 микролитров аликвоты из общего клеточного лизата, полученного после разделения гранул, для вестерн-блоттинга. Промойте бусины три раза одним миллилитром ледяного лизисного буфера. Затем добавьте 50 микролитров буфера для образцов в гранулы.

После смешивания суспензии методом вортексинга, прокипятите ее при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут с помощью нагревателя сухого блока. Эта фракция содержит изолированные адгезионные комплексы. Приступайте к биохимическому анализу или храните фракцию при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Этот рисунок показан для демонстрации очистки адгезионных комплексов. Иммуноблоттинг GAPDH используется в качестве контроля нагрузки на общий лизат клеток и для проверки чистоты адгезионных комплексов. Длительная экспозиция использовалась для подтверждения отсутствия цитоплазматического сигнала в очищенной фракции комплекса адгезии.

Гранулы, покрытые фибронектином, были использованы для исследования процессов механической трансдукции, которые происходят с течением времени в адгезионных комплексах в ответ на напряжение. После магнитного разделения фракции адгезионного комплекса лизат и фракция адгезионного комплекса анализировали методом вестерн-блоттинга. Для контроля нагрузки и кандидатов, о которых известно, что они рекрутируются или фосфорилируются в адгезионных комплексах в ответ на механическое напряжение, проводили иммуноблоттинг.

В то время как напряжение не влияло на рекрутирование паксиллина в адгезионные комплексы, его фосфорилирование на тирозине 31 усиливалось в ответ на механическое напряжение как в общем клеточном лизате, так и во фракции адгезионного комплекса. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как применять силы растяжения к белкам адгезионной поверхности с помощью магнитных шариков. После освоения этой техники ее можно сделать за два часа, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости быть осторожным с мощными магнитами. После этой процедуры могут быть проведены биохимические исследования, такие как вестерн-блоттинг, анализ полимеризации актина или ферментативный анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, регулируется ли активность киназы напряжением. Этот метод может помочь исследователям в области клеточной биологии исследовать магниточувствительные сигнальные пути в клетках.