Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом побратимов гистонов

Общая цель данного биохимического протокола — получение нуклеосом с сестринскими гистонами, имеющими различную изотопную метку. Это необходимо для одновременного картирования реакций посттрансляционной модификации на обоих сестринских гистонах. Общая цель данного биохимического протокола — получение нуклеосом с сестринскими гистонами, имеющими различную изотопную метку, для использования при одновременном картировании посттрансляционных модификаций на обоих сестринских гистонах.

Данный метод в сочетании с методами высокого разрешения для картирования посттрансляционных модификаций, такими как масс-спектрометрия, позволяет ответить на ключевые вопросы биологии хроматина, например, какие механизмы способствуют формированию симметрично модифицированных нуклеосом? Главным преимуществом этой техники является возможность ее простого внедрения в биохимическую лабораторию, так как она сочетает в себе стандартные протоколы реконституции нуклеосом с общепринятыми методиками очистки белков. Для реконституции октамера будут использованы две пула гистона H3.

H3, меченный азотом 15, содержащий полигистидиновый тег на аминоконце, и H3, меченный углеродом 13, содержащий стрептавидин-аффинный тег на аминоконце. Начните выполнение данной процедуры с растворения аликвот лиофилизированных гистонов, включая оба типа гистона H3, в буфере для разворачивания. В каждую пробирку, содержащую около пяти миллиграммов гистонов, добавьте один миллилитр буфера для разворачивания и перемешайте путем пипетирования, не используя вортекс.

Выдержите пробирки на льду в течение 30 минут для полного разворачивания белков. Затем измерьте абсорбцию при 280 нанометрах, чтобы определить точную концентрацию каждого гистона. Смешайте основные гистоны в равных молярных соотношениях, учитывая, что необходимо включить по 50% каждого из двух пулов гистона H3.

Используйте буфер для развертывания, чтобы довести конечную концентрацию белка примерно до 1 mg/mL. Перенесите смесь в диализную мембрану с порогом отсечения 6 kDa. Проведите диализ против 1–2 л охлажденного буфера для рефолдинга при температуре 4 °C.

На следующий день соберите диализованный материал и удалите любые осадки путем центрифугирования в микроцентрифуге в течение пяти минут при температуре 4 °C на максимальной скорости. После определения концентрации октамера используйте центрифужный фильтр-насадок с порогом отсечения 10 кДа, чтобы сконцентрировать октамер до конечного объема примерно 2 мл. Должна быть получена концентрация октамера от 50 до 100 мкМ.

Подготовьтесь к гель-фильтрации, подключив колонку для гель-фильтрации к системе FPLC. Уравновесьте колонку двумя колоночными объемами (CV) дегазированного рефолдингового буфера, отфильтрованного через мембрану с порами 0.22 µm. Введите концентрированный материал со скоростью потока 1 mL/min и собирайте фракции объемом от 1 до 1.5 mL.

Для начала данной процедуры объедините соответствующие фракции, содержащие чистые октамеры, и определите концентрацию, как было описано ранее. Подключите колонку с никель-нитрилотриуксусной кислотой или никель-NTA объемом 1 мл к системе FPLC. Проведите уравновешивание 10 CV отфильтрованным через мембрану 0,22 мкм и дегазированным буфером для рефолдинга при скорости потока 1 мл/мин.

Пропустите очищенный октамер через никель-NTA со скоростью потока 1 мл/мин. Соберите фракцию проскока. Проведите элюцию 10 CV буфера для рефолдинга, содержащего 250 мМ имидазола, со скоростью потока 1 мл/мин.

Соберите элюат после очистки на никелевом NTA. Очистку на основе стрептавидина желательно проводить в холодном помещении. Уравновесьте аффинную колонку объемом 1 мл с коммерческим стрептавидином, пропустив 10 CV буфера для рефолдинга, содержащего 250 мМ имидазола, с использованием установки для гравитационного потока в режиме периодического процесса.

Пропустите элюат из колонки с никель-NTA через аффинную колонку со стрептавидином. Соберите фракцию проскока. Проведите элюцию 10 CV рефолдингового буфера, содержащего 2,5 millimolar дестиобиотина.

Соберите элюат. После измерения концентрации октамера в элюате добавьте TEV-протеазу в количестве, в 10 раз меньшем по сравнению с концентрацией белка, и оставьте реакционную смесь инкубироваться на ночь при температуре 4 °C. На следующий день перенесите смесь в диализную мембрану с порогом отсечения 50 кДа и проведите диализ против буфера для рефолдинга в течение ночи при температуре 4 °C.

Сконцентрируйте очищенный асимметричный октамер с помощью центрифужного фильтрующего устройства с порогом отсечения 10 кДа до объема одного-двух миллилитров. Ожидаемая концентрация октамера составляет 20–50 мкМ. Для реконституции нуклеосом требуется ДНК, содержащая последовательность позиционирования нуклеосом.

Доведите концентрацию соли в растворе ДНК до 2 M NaCl, используя 5 M стоковый раствор хлорида натрия. Смешайте ДНК с октамером и буфером для рефолдинга, используя оптимальное соотношение октамера к ДНК, определенное в ходе предварительного теста в малом масштабе. Добавляйте октамер в последнюю очередь, чтобы исключить любую возможность смешивания октамера и ДНК при концентрации соли ниже 2 M.

Перенесите смесь в диализную мембрану с порогом отсечения 6 кДа и диализируйте против 1 л буфера для рефолдинга в течение ночи при 4 °C. На следующий день ступенчато снижайте концентрацию соли в диализном буфере, выдерживая образец в каждом буфере с хлоридом натрия не менее трех часов.

Затем перенесите диализную мембрану в стакан с одним литром анализационного буфера и продолжайте диализ в течение ночи при температуре четырех градусов Celsius. На следующий день соберите диализированный образец. Удалите образовавшийся осадок путем центрифугирования в микроцентрифуге в течение пяти минут при температуре четырех градусов Celsius на максимальной скорости.

Сконцентрируйте образец с помощью центрифужного фильтрующего устройства с пределом отсечки 30 кДа до конечного объема около 300 мкл. Измерьте концентрацию ДНК при 260 нм. Конечная концентрация должна находиться в диапазоне от 10 до 20 мкМ.

Храните образец при температуре 4 °C до нескольких недель. Профиль элюции смеси рефолдированных гистонов при гель-фильтрации показывает, что гистоновые октамеры элюируют примерно при 70 мл. Электрофорез в ПААГ с SDS подтверждает правильную стехиометрию гистонов.

Реконструированный пул октамеров, содержащий три типа октамеров, подвергают схеме тандемной аффинной очистки. Изоляция асимметричных форм подтверждается наличием аффинного тега. Затем аффинные теги удаляют с помощью TEV-протеазы.

Реконструирование нуклеосом в малом масштабе с использованием различных молярных соотношений ДНК и октамера показало, что оптимальным является соотношение один к одному. Реконструирование нуклеосом в большом масштабе было выполнено с использованием оптимизированного молярного соотношения ДНК и октамера, при этом наблюдалась правильная стехиометрия четырех основных гистонов. ЯМР-спектроскопия дифференциально изотопно-меченных нуклеосом подтвердила наличие сестринских гистонов H3, меченных азотом 15 и углеродом 13.

В данном примере применения нуклеосомы, подвергнутые дифференциальному изотопному мечению и асимметричному фосфорилированию по C-кольцу 10 гистона H3, вводили в реакцию с ацетилтрансферазой GCN5. Затем с помощью ЯМР-спектроскопии в режиме реального времени отслеживали ацетилирование лизина 14 гистона H3 в обеих копиях H3. Анализ показал, что фосфорилирование C-кольца 10 гистона H3 стимулирует ацетилирование лизина 14 гистона H3 под действием GCN5 по типу цис-взаимодействия сильнее, чем по типу транс-взаимодействия.

После освоения эта методика может быть выполнена за пять дней при условии правильного проведения всех этапов. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как реконструировать нуклеосомы, содержащие сестринские гистоны с различными характеристиками.