Управляемая Expression ионного канала через Индуцибельные временная трансфекция

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы обеспечить удобный способ контроля экспрессии ионных каналов в гетерологичных системах, избегая при этом длительных осложнений клеточной культуры. Таким образом, можно контролировать условия между экспериментами и получать более воспроизводимые результаты. Этот метод может помочь облегчить исследования в области ионных каналов.

Например, характеристика свойств каналов в фармакологии. Поскольку современные методы либо сложны, либо демонстрируют несогласованную экспрессию белка. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем достичь контролируемых уровней экспрессии широкого спектра белков, адаптированных для отдельных экспериментов, за относительно короткое время.

Чтобы начать эту процедуру, перенесите клетки TREX 293 в 12-луночный планшет, приготовленный с 0,9 миллилитрами полного DMEM на лунку для получения 50-процентной конфлюенции. И инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в CO2-инкубаторе. Затем приготовьте трансфекционную смесь, состоящую из DMEM, представляющего интерес гена, показанного здесь, TRPV1, инертной плазмиды, и реагента для липидной трансфекции.

Для электрофизиологических экспериментов включите EGFP в экспрессирующую плазмиду млекопитающих в коктейль для трансфекции, чтобы визуализировать клетки, которые успешно подвергаются трансфекции. Инкубируйте трансфекционную смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем трансфицируйте клетки путем пипетирования трансфекционной смеси по каплям на покрытые клетки в 12-луночном планшете.

Энергично раскачивайте плиту, чтобы обеспечить однородное диспергирование ДНК и трансфективного реагента. После этого инкубируйте трансфицированные клетки в течение ночи при температуре 27 градусов Цельсия. На следующее утро, если вы проводите электрофизиологию, подтвердите, что клетки были успешно трансфицированы, наблюдая флуоресцентный сигнал EGFP под ультрафиолетовой лампой.

При выполнении электрофизиологии перенесите клетки из 12-луночного планшета в покровные листы с покрытием PDL в 500 микролитрах полного DMEM. При выполнении визуализации кальция определите около 20 000 клеток в камерах для визуализации кальция с покрытием PDL. В этой процедуре готовят доксициклиновый стоковый раствор из расчета один миллиграмм на миллилитр в дважды дистиллированной воде.

Защищайте стоковый раствор от света при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех недель. Для длительного хранения держите стоковый раствор доксициклина при температуре минус 20 градусов Цельсия. Далее приготовьте свежий раствор доксициклина в полном объеме ДМЭМ.

И прогрейте его до 37 градусов по Цельсию. Для электрофизиологической регистрации пипеткой вносите 500 микролитров раствора доксициклина в концентрации 2 мкг на миллилитр в каждую лунку, чтобы получить конечную концентрацию доксициклина в 1 мкг на миллилитр. Для визуализации кальция добавьте 100 микролитров раствора доксициклина в дозе три микрограмма на миллилитр в каждую лунку, чтобы получить концентрацию доксициклина в одну микрограмм на миллилитр.

Инкубируйте образец в течение желаемого времени для индукции при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах CO2. Чтобы откалибровать экспрессию белка с помощью визуализации кальция, приготовьте раствор Рингера и нагрейте его до 37 градусов Цельсия. Чтобы помочь диспергировать эфиры АМ, индикаторы флюоресцентных ионов, такие как Fura-2 в водных растворах, готовят раствор неионогенного F-127 в ДМСО.

Нагрейте раствор до 27 градусов Цельсия до тех пор, пока неионогенный F-127 не растворится. Затем храните неионогенный раствор F-127 при комнатной температуре и снова нагрейте его до 37 градусов Цельсия перед использованием. После этого приготовьте загрузочный раствор Фура-2 АМ из раствора Рингера, дополненный двумя-тремя микромолярами Фура-2 АМ, 02 мг на миллилитр неионогенного F-127 и 10 миллимолярными D-глюкозами.

Затем аспирируйте среду из ячеек в камерах и замените ее загрузочным раствором Фура-2 АМ. Инкубируйте клетки в течение 60 минут при комнатной температуре в темноте. После этого аспирируйте раствор Фура-2 АМ.

И промойте клетки раствором Рингера и 10 миллимолярным раствором D-глюкозы, чтобы удалить лишний клеточный краситель. Оставьте в каждом по 200 микролитров раствора D-глюкозы по методу Рингера и 10 миллимоляров. И инкубировать его в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.

Через 30 минут поместите камеру на предметный столик над наконечником микроскопа и закрепите ее держателем. Затем рассчитайте и приготовьте рабочую концентрацию специфического агониста TRPV1 капсаизина в соответствии с конечной желаемой концентрацией. Затем включите лампу, камеру и микроскоп и выберите фильтр Fura-2 для обнаружения излучения на длине волны 510 нанометров.

Отрегулируйте желаемое увеличение и сфокусируйте клетки в выбранном поле, манипулируя этими параметрами с помощью ручек микроскопа. В темное время суток убавляем фоновый свет и устанавливаем время экспозиции. Установите выборку изображения с желаемой скоростью.

Затем начните с регистрации флуоресцентного отклика элементов, нагруженных Fura-2, возбуждая их на длинах волн 340 и 380 нанометров. Соотношение от 340 до 380 сигналов является показателем внутриклеточной концентрации кальция и, следовательно, активности TRPV1. Затем добавьте два микромолярных капсаицина в 200 микролитров раствора Рингера для создания конечной насыщающей концентрации одного микромолярного капсаицина с целью оценки уровня экспрессии TRPV1 и анализа ответа TRPV1.

Чтобы определить идеальное время индукции для одноканальной записи, сначала подготовьте растворы для ванны и дозатора. Затем подготовьте несколько стеклянных пипеток, отполированных огнем до сопротивления от 10 до 12 мегаом. Выполните зажим целой клетки, создав уплотнение на мембране целевой клетки.

Впоследствии установите удерживающий потенциал на отрицательные 40 милливольт. И разорвите мембрану, приложив отрицательное давление. После этого с помощью микроманипулятора поднимите пипетку с мебрановым пластырем от клетки.

Затем расположите систему Profusion непосредственно рядом с пипеткой, содержащей мембранный пластырь. Уменьшите фильтр Бесселя и выходное усиление до двух-пяти киллагурц и 10 ампер соответственно. После этого обильно нанесите насыщающие концентрации агониста на мембранный пластырь.

Затем проанализируйте количество успешно записанных одноканальных патчей в зависимости от времени индукции, приложенного к ячейкам, и отрегулируйте время индукции в соответствии с желаемыми результатами. Здесь показаны псевдоцветные изображения клеток TREX 293, временно экспрессирующих RTRPV1, до и после применения капсаицина. А вот соответствующие изменения внутриклеточного уровня кальция с течением времени в обработанных, трансфицированных клетках TREX 293.

Каждый график представляет в среднем 50 ячеек. Вероятность успешного использования одноканального патча в записях TRPV1 зависит от времени индукции. Вот текущие следы патчей из клеток TREX 293, временно экспрессирующих RTRPV1 после двух и четырех часов индукции.

А этот график описывает количество каналов в патче после указанного времени индукции. Этот метод может дать нам анализ белка с контролируемой экспрессией в течение 12 часов после трансфекции, если она выполнена правильно. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о стандартизации концентраций трансфекции и времени индукции для различных белков.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создать управляемую систему экспрессии эффективным по времени способом для выбранного вами иона.