Анализ лимфоцитов экстравазации спользование In Vitro Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Общей целью данного анализа трансмиграции является исследование экстравазации лимфоцитов в центральную нервную систему in vitro. Этот метод может помочь в углублении нашего понимания воспалительных заболеваний центральной нервной системы и в разработке новых терапевтических подходов. Некоторые преимущества этого метода заключаются в том, что он легко доступен и позволяет анализировать популяции редких лимфоцитов на уровне отдельных клеток.

Этот метод может дать представление о трансмиграции лимфоцитов через гематоэнцефалический барьер и может быть применен для изучения трансмиграции через гематоэнцефалический барьер. Кроме того, анализ проникновения синего цвета Эванса может быть выполнен для оценки целостности модели гематоэнцефалического барьера. Начните с того, что накройте дно колбы для клеточных культур Т-25 двумя миллилитрами свежеприготовленного раствора фибронектина в течение как минимум трехчасовой инкубации в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

В конце инкубации замените раствор фибронектина на 7,2 умножить на 10 до четвертой микрососудистой эндотелиальной клетки головного мозга человека, или HBMEC, в шести миллилитрах полной среды ECM-b и верните колбу в инкубатор. Когда HBMEC достигнет 80% конфлюенции, переложите надосадочную жидкость в 15-миллилитровую коническую трубку и трижды промойте адгезивные клетки пятью миллилитрами PBS. После третьего промывания добавьте в клетки два миллилитра предварительно подогретого раствора Аккутазы на две минуты при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем несколько раз сильно постучите по колбе, подтвердив отслоение клеток с помощью световой микроскопии. Когда клетки начнут подниматься со дна колбы, используйте собранную надосадочную жидкость для многократного промывания колбы до тех пор, пока большая часть HBMEC не будет ресуспендирована. Затем переносим клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую пробирку для центрифугирования, а гранулу повторно суспендируем в одном миллилитре свежей среды ECM-b для подсчета.

Чтобы подготовить вкладыши для клеточных культур к анализу трансмиграции, сначала добавьте 100 микролитров раствора фибронектина в каждую вставку и в одну лунку 96-луночной пластины с плоским дном. Через три часа при температуре 37 градусов Цельсия замените раствор фибронектина на 100 микролитров HBMEC и добавьте 600 микролитров свежей среды ECM-b в нижние отсеки вставок для клеточных культур. Затем верните планшеты в инкубатор для клеточных культур на три-четыре дня.

Чтобы проверить, достигнута ли барьерная целостность, аспирируйте среду из нижнего и верхнего отсеков одной вставки для клеточной культуры и добавьте во вкладыш 100 микролитров свежеприготовленного раствора синего Эванса. Добавьте в нижний отсек 600 микролитров PBS с добавлением В27, и верните тарелку в инкубатор. Через час с помощью щипцов осторожно извлеките вкладыш и перенесите 100 микролитров PBS B27 из нижнего отсека в две отдельные лунки из черного полистирола, 96-луночной пластины с плоским дном.

Затем загрузите пластину в многорежимный считыватель микропланшетов и определите оптимальное z-положение. Чтобы определить барьерную функцию HBMEC, измерьте возбуждение раствора синего красителя Эванса с использованием соответствующих настроек и сравните полученные данные со стандартной кривой, изображающей проникновение синего цвета Эванса через HBMEC в разные моменты времени после посева. После подтверждения образования монослоя клетки ресуспендировать мононуклеарную клетку периферической крови, или ПМЦ, образец до концентрации от пяти до 10 до 6 клеток на миллилитр в среде RPMI с добавлением В27.

Затем аспирируют среду из нижнего и верхнего отделов соответствующего числа вкладышей для клеточных культур, содержащих сливающиеся монослои HBMEC, и добавляют 100 микролитров PBMC на донора во вкладыши для клеточных культур и в одну лунку 24-луночного планшета на контроль in vitro. Добавьте 600 микролитров RPMI плюс B27 в нижние отсеки вкладышей для клеточных культур и 500 микролитров в контрольные лунки in vitro и верните планшеты в инкубатор для клеточных культур на шесть часов. В конце инкубации с помощью щипцов удалите вставки клеточных культур, тщательно промыв донышки 400 микролитрами PBS, не касаясь мембран.

Затем тщательно перемешайте 20 микролитров флюоросфер с клетками в экспериментальных и контрольных лунках in vitro и перенесите один миллилитр полученных суспензий PBMC в соответствующие пробирки проточной цитометрии. Соберите клетки центрифугированием и добавьте к каждому образцу интересующие флуорохром-конъюгированные антитела в 100 микролитрах буфера для проточной цитометрии. Через 30 минут при четырех градусах Цельсия промойте клетки 250 микролитрами свежего буфера проточной цитометрии и повторно суспендируйте гранулы в соответствующем объеме буфера проточной цитометрии для анализа.

Когда все данные будут получены, откройте соответствующее программное обеспечение для анализа проточной цитометрии. Чтобы проанализировать трансмиграцию субпопуляции NK-клеток, сначала выберите лимфоциты на графике бокового и прямого каналов рассеяния и отобразите клетки на точечной диаграмме CD3 и CD56. Затем выберите CD56-положительные, CD3-отрицательные NK-клетки.

Чтобы различить субпопуляции трансмигрировавших NK-клеток, отобразите клетки на графике CD56 и CD16 и гейте для CD56bright, CD16dim или отрицательных и CD56dim, CD16-положительных клеток. Затем выберите флюоросферы с числом потоков на диаграмме прямого и бокового рассеяния. Чтобы определить число шариков, отобразите выбранные данные на графике канала, охватывающего длину волны излучения от 525 до 700 нанометров в зависимости от времени.

Наконец, определите процент мигрировавших NK-клеток как отношение между общим числом мигрировавших клеток и общим числом клеток в контроле in vitro. После трех-четырех дней культивирования HBMEC экспрессировал плотное соединение молекулы Zonula occludens-1 и выращивал монослои, которые демонстрируют трансэндотелиальное электрическое сопротивление и сниженное проникновение синего красителя Эванса. Стимуляция монослоя эндотелиальных клеток интерфероном гамма и ФНО альфа в течение 24 часов перед анализом трансмиграции всего PBMC приводит к увеличению миграции всех анализируемых популяций лимфоцитов.

Интересно, что CD56bright, CD16dim или отрицательные NK-клетки демонстрируют более высокую миграционную способность, чем CD56dim, CD16-положительные NK-клетки как в нестимулированном, так и в цитокин-активируемом HBMEC. Несмотря на то, что относительное увеличение трансмиграции через воспаленный клеточный монослой выше для CD56dim клеток в целом, что соответствует наблюдениям in vivo, согласно которым CD56bright, CD16dim-отрицательные NK-клетки обогащаются в интратекальном компартменте. Освоив одну, эту технику можно выполнить в течение 10 часов.

Предварительная обработка установки для трансмиграции in vitro интерфероном гамма и TNF альфа позволяет изучить миграцию лимфоцитов при воспалительных состояниях. Наш протокол может быть модифицирован путем приложения сил сдвига или совместного культивирования с другими клетками гематоэнцефалического барьера, такими как астроциты, чтобы обеспечить уточненную модель трансмиграции лимфоцитов в центральную нервную систему. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как исследовать трансмиграцию лимфоцитов с помощью модели гематоэнцефалического барьера человека in vitro.