Изоляция, характеристика и очистки макрофагов из пострадавших от связанных с ожирением воспаление тканей

Общая цель данной процедуры заключается в эффективном выделении и характеристике макрофагов из тканей, которые обычно подвержены воспалению, вызванному диетой, например, из печени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии и воспаления о том, как фенотип резидентных макрофагов тканей может определять прогрессирование хронических воспалительных заболеваний. Основным преимуществом данного подхода является оптимизация этапов выделения, необходимых для получения суспензий одиночных клеток из тканей, пораженных вялотекущим хроническим воспалением, обусловленным ожирением.

Процедуру продемонстрирует Джослин Аллен, аспирантка моей лаборатории. Чтобы изолировать печень, сначала поместите мышь, подвергнутую воздействию этанола, в положение на спине на препарировочную доску из пенополистирола и зафиксируйте передние и задние лапы. Затем с помощью пинцета со средней остротой кончиков захватите кожу живота рядом с отверстием уретры и с помощью острых препарировочных ножниц сделайте небольшой надрез в приподнятой коже.

Введите нижнее лезвие ножниц в разрез между кожей и брюшиной и сделайте латеральный разрез от паха до подбородка. Осторожно отодвиньте кожу, чтобы обнажить неповрежденную брюшную полость и грудную стенку, и сделайте латеральный разрез через брюшину. Приподнимите грудину и аккуратно рассеките диафрагму.

Затем отодвиньте органы желудочно-кишечного тракта в сторону и найдите подпеченочный отдел нижней полой вены (НПВ). С помощью гемостатического зажима пережмите супрапеченочный отдел НПВ для обеспечения локальной перфузии; при этом к системе для забора и переливания крови с иглой 23G присоедините шприц, заполненный предварительно прогретым перфузионным буфером. Осторожно нажмите на plunger, пока трубка и игла не заполнятся перфузионным буфером, и введите иглу параллельно подпеченочному отделу НПВ.

Правильная канюляция НПВ обеспечивает локальное распределение буфера для диссоциации по всей печени и периферическим тканям, что оптимизирует переваривание ткани. Используйте четырехсантиметровый гемостатический зажим для фиксации иглы и осторожно нажмите на поршень, чтобы начать перфузию. Если игла расположена правильно, печень быстро обесцветится, а ее доли увеличатся в размере.

Незамедлительно перережьте воротную вену, чтобы перфузионный буфер мог свободно проходить через печень, время от времени осторожно массируя доли между большим и указательным пальцами для облегчения вымывания крови. Когда останется всего пять миллилитров перфузионного буфера, замените шприц с перфузионным буфером на шприц, заполненный предварительно нагретым буфером для диссоциации; продолжайте осторожно массировать доли и перфузировать печень до полного ее переваривания. Подтвердите успешное переваривание, аккуратно нажав тупым концом пинцета на левую латеральную долю.

На поверхности должна появиться вмятина, которая медленно заполняется после удаления пинцета. Затем извлеките иглу и с помощью короткого прямого лезвия диссекционных ножниц осторожно перережьте соединительные связки, чтобы иссечь всю печень и желчный пузырь. Перенесите печень в чашку диаметром 10 сантиметров, содержащую 10 миллилитров ледяного DMEM, и с помощью зубчатого пинцета захватите перерезанную супрагепатическую часть IVC.

Используя пинцет среднего размера, быстрыми движениями обработайте каждую долю, чтобы освободить клетки из капсулы Глиссона, и пропустите насыщенный DMEM через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл на льду. Высокий выход жизнеспособных клеток может быть достигнут только при правильной диссоциации клеток печени из капсулы Глиссона. После сбора всех клеток переверните пробирку для осторожного перемешивания клеточной суспензии и осадите клетки путем центрифугирования.

Перенесите супернатант в новый конический пробирку объемом 50 миллилитров для трех последующих центрифугирований при низких оборотах. После последнего центрифугирования перенесите супернатант в новую пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте клетки еще один раз при более высокой скорости. Затем ресуспендируйте осадок непаренхиматозных клеток в буфере для FACS для подсчета и разведите клетки печени до соответствующей концентрации в зависимости от последующего применения в маркированных полистироловых пробирках с круглым дном объемом пять миллилитров.

У мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров или диету с высоким содержанием жиров и холестерина, наблюдается усиление инфильтрации классически активированных макрофагов M1 в пораженных тканях, таких как аорта. Количество экспрессирующих рецептор RON аортальных CD45-положительных F4/80-положительных макрофагов, демонстрирующих противовоспалительный фенотип, снижается у мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров и холестерина, в то время как в аортах, выделенных из этих животных, обнаруживается повышенное число провоспалительных CD45-положительных F4/80-положительных CD11c-положительных макрофагов. Кроме того, экспрессирующие рецептор RON макрофаги, выделенные методом сортинга из перевариваемых тканей аорты, демонстрируют повышенную экспрессию гена Arginase 1, который является общепризнанным маркером макрофагов M2.

Действительно, характеристика резидентных макрофагов печени выявляет преобладающий фенотип субпопуляций, экспрессирующих рецептор RON, с CD11c-положительными провоспалительными популяциями макрофагов, демонстрирующими снижение экспрессии генов, которые тесно связаны с противовоспалительным фенотипом M2. Аналогичные тенденции наблюдаются в популяциях макрофагов, выделенных из гомогенизированной белой жировой ткани, где популяции макрофагов с провоспалительным фенотипом демонстрируют снижение поверхностной экспрессии рецептора RON. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает от 20 до 30 минут на одно животное.

После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как проточная цитометрия, флуоресцентно-активированная сортировка клеток и/или количественная ПЦР, для дальнейшей характеристики фенотипа изолированных резидентных макрофагов печени. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как правильно изолировать резидентные макрофаги из пораженной печени. Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.