Изоляция, характеристика и очистки макрофагов из пострадавших от связанных с ожирением воспаление тканей

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы эффективно изолировать и охарактеризовать макрофаги из тканей, обычно пораженных воспалением, вызванным диетой, таких как печень. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии и воспаления о том, как фенотип тканевых резидентных макрофагов может диктовать прогрессирование хронических воспалительных заболеваний. Основное преимущество заключается в том, что процедура оптимизирует этапы выделения, необходимые для получения суспензий одиночных клеток, полученных из тканей, пораженных ожирением и хроническим воспалением низкой степени злокачественности.

Демонстрировать процедуру будет Джоселин Аллен, аспирант из моей лаборатории. Чтобы изолировать печень, сначала поместите пропитанную этанолом мышь в лежачее положение на доске для препарирования пенополистирола и закрепите переднюю и заднюю лапы. Затем с помощью щипцов со средним концом захватите кожу живота возле отверстия уретры и с помощью острых ножниц для рассечения сделайте небольшой разрез на приподнятой коже.

Вставьте нижнее лезвие ножниц в разрез между кожей и брюшиной и сделайте боковой разрез от паха до подбородка. Аккуратно оттяните кожу, чтобы обнажить неповрежденную брюшную полость и грудную стенку, и сделайте боковой разрез через брюшину. Поднимите грудину и аккуратно надрежьте диафрагму.

Затем переместите органы желудочно-кишечного тракта в сторону и расположите подпеченочную нижнюю полую вену или НПВ. С помощью гемостатических щипцов зажмите надпеченочный НПВ для поддержания локализованной перфузии и прикрепите шприц, наполненный предварительно подогретым перфузионным буфером, к набору для сбора крови и инфузии 23-го калибра. Осторожно нажмите на поршень до тех пор, пока трубка и игла не будут заполнены перфузионным буфером, и введите иглу параллельно подпеченочному НПВ.

Правильная канюляция НПВ гарантирует, что буфер диссоциации локально распределяется по печени и периферическим тканям, оптимизируя переваривание тканей. Используйте четырехсантиметровый гемостатический зажим, чтобы зафиксировать иглу на месте, и осторожно нажмите на поршень, чтобы начать перфузию. Если игла расположена правильно, цвет будет быстро смываться с печени, и доли станут увеличенными.

Немедленно перережьте воротную вену, чтобы перфузионный буфер мог свободно протекать через печень, время от времени осторожно массируя доли между большим и указательным пальцами, чтобы облегчить удаление крови. Когда останется всего пять миллилитров перфузионного буфера, замените шприц перфузионного буфера на шприц, наполненный предварительно подогретым диссоциативным буфером, продолжая мягко массировать доли и перфузию печени до тех пор, пока она полностью не переварится. Подтвердите успешное пищеварение, аккуратно прижав тупой край щипцов к левой боковой доле.

На поверхности должно появиться углубление, которое медленно заполняется после удаления щипцов. Затем извлеките иглу и с помощью короткого прямого лезвия из пары ножниц для препарирования аккуратно разрежьте соединительные связки, чтобы иссечь всю печень и желчный пузырь. Перенесите печень в 10-сантиметровую посуду, содержащую 10 миллилитров ледяного ДМЭМ, и с помощью зубчатых щипцов захватите отрезанную надпеченочную НПВ.

Используя щипцы средней точки, нанесите быстрые поглаживающие движения на каждую долю, чтобы освободить клетки из капсулы Глиссона, и пропустите насыщенный DMEM через клеточное сетчатое фильтр 70 микрометров в конической трубке объемом 50 миллилитров на льду. Высокий выход жизнеспособных клеток может быть достигнут только при правильной диссоциации клеток печени из капсулы Глиссона. Когда все клетки будут собраны, переверните пробирку, чтобы аккуратно перемешать клеточную суспензию и гранулировать клетки центрифугированием.

Перенесите надосадочную жидкость в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров для еще трех центрифугий с низким уровнем вращения. После последнего центрифугирования переложите надосадочную жидкость в новую 50-миллилитровую пробирку и центрифугируйте клетки еще раз с более высокой скоростью. Затем ресуспендируйте непаренхиматозную клеточную гранулу в буфере FACS для подсчета и разбавьте клетки печени до соответствующей концентрации в соответствии с их последующим применением в меченых пятимиллилитровых полистирольных пробирках с круглым дном.

У мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров или высоким содержанием жиров и высоким содержанием холестерина, наблюдается повышенная инфильтрация классически активированных макрофагов М1 в пораженные ткани, такие как аорта. Рецептор RON, экспрессирующий аортальные CD45-положительные F4/80-положительные макрофаги, которые демонстрируют противовоспалительный фенотип, снижены у мышей с высоким содержанием жиров и высоким содержанием холестерина, в то время как провоспалительные CD45-положительные F4/80-положительные CD11c положительные макрофаги обнаруживаются в повышенном количестве в аортах, выделенных от этих животных. Кроме того, отсортированные макрофаги, экспрессирующие рецептор RON, полученные из переваренных аорт, демонстрируют повышенную экспрессию гена аргиназы 1, хорошо известного маркера макрофагов M2.

Действительно, характеристика резидентных макрофагов печени выявляет преобладающий фенотип субпопуляций, экспрессирующих рецептор RON с CD11c-положительными провоспалительными популяциями макрофагов, демонстрируя сниженную экспрессию генов, которые тесно связаны с антивоспалительным фенотипом M2. Аналогичные тенденции наблюдаются в популяциях макрофагов, выделенных из переваренной белой жировой ткани, с провоспалительными фенотипными популяциями макрофагов, демонстрирующими сниженную поверхностную экспрессию рецептора RON. После освоения этой техники она может быть выполнена за 20-30 минут на животное, если она выполнена правильно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как проточная цитометрия, сортировка флуоресцентно-активируемых клеток и/или количественная ПЦР для дальнейшей характеристики фенотипа выделенных тканевых резидентных макрофагов печени. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как правильно выделять тканевые-резидентные макрофаги из больной печени. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.