Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Конформационная гибкость играет решающую роль в функционировании белка, и общая цель масс-спектрометрии обмена водорода и дейтерия с электрораспылением с временным разрешением заключается в исследовании быстрых структурных изменений, которые управляют функцией упорядоченных и неупорядоченных белков. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области структурной биологии, такие как кратеризация транзиторных подтверждений белков, что не является минимумом для классических методов с высоким разрешением, таких как электроцистография и ЯМР. Основное преимущество этого метода заключается в том, что реакции можно контролировать в миллисекундном масштабе времени, что важно для характеристики петлевых гребней, Moltinglobyals и внутренне неупорядоченных белков.

Применение этой техники распространяется и на терапию нейродегенеративных расстройств. Поскольку они часто включают в себя неправильное сворачивание или агрегацию внутренне неупорядоченных белковых областей. Хотя этот метод может дать представление о недельных структурированных белках, он также может быть применен к другим системам, таким как ферменты, претерпевающие каталитический оборот, или для характеристики белков, белков и белковых взаимодействий.

Чтобы начать эту процедуру, лазером проведите пластину через входной канал для введения реагентов, продиализную камеру и выходной канал на стандартном блоке PMM8 с помощью лазерного гравера. После этого разрежьте металлический капилляр из нержавеющей стали 30 калибра на две части по 10 сантиметров с помощью вращающегося инструмента для отрезного диска толщиной 164 дюйма. Используйте наждачную бумагу, чтобы разгладить конец капилляров, чему может способствовать просмотр под световым микроскопом.

Теперь расплавьте эти капилляры в травленом блоке PMM8 с помощью прогуливающегося утюга. Чтобы построить кинетический смеситель с непрерывным потоком и временным разрешением, вставьте 40-сантиметровый капилляр из плавленого стекла чили в стальной металлический капилляр 28 калибра длиной примерно 15 сантиметров. Затем сделайте двухмиллиметровую выемку, используя настройки лазерного гравера малой мощности на одном конце внутреннего стеклянного капилляра, и запечатайте этот конец внутреннего стеклянного капилляра.

Это критически важный этап, который обеспечивает ортогональное и эффективное перемешивание белка, который выходит через выемку, которая обычно разрушается. Двухмиллиметровое межкапиллярное пространство между выемкой и концом капилляра — это смесь и объем. Прикрепите фитинги и втулки трубок соответствующего размера и вставьте Т-образный соединитель, который будет использоваться для обеспечения ухудшения.

Далее выровняйте внутренний стеклянный капилляр с концом металлического капилляра, что можно облегчить, рассматривая под световым микроскопом. Отметьте это положение как нулевой миллиметр. Прикрепите этот кинетический миксер к одному концу смесительного Т. Затем прикрепите 40-сантиметровый капилляр из плавленого кварцевого стекла к противоположному концу кинетического миксера на смесительном Т. Для активации пепсина суспензируйте 20 миллиграммов пепсина из слизистой оболочки газообразных Porsena в одном миллилитре буфера для связи.

Добавьте 50 миллиграммов активированных NHS скоростей в ресуспендированные протиены и аккуратно вращайте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день уменьшите температуру смеси в тысячу раз G в течение двух минут при комнатной температуре, чтобы собрать смолу. Затем отсасывайте несвязанные протии.

После этого инкубируйте агрос в одном миллилитре блокирующего буфера и аккуратно переворачивайте при комнатной температуре в течение часа. После сбора смолы и аспирации блокирующего буфера инкубируйте пепсин аггурос с одним миллилитром пятипроцентной уксусной кислоты в течение пяти минут. Уменьшите массу при температуре 1 000 раз по G в течение двух минут при комнатной температуре, чтобы собрать смолу, затем отасуньте супернатант.

Повторив предыдущие шаги, в общей сложности три стирки, храните бусины в одном миллилитре уксусной кислоты при температуре четыре градуса Цельсия для длительного использования. Чтобы собрать устройство, заполните камеру протиализа суспензией из активированных гранул пепсина аггурос в пятипроцентной ацединовой кислоте с помощью стерильного шпателя. Поместите микрофалитическую платформу из ПММА между двумя пустыми блоками из ПММА в качестве крышки для герметизации устройства, облицованной силиконовой резиной для создания герметичного уплотнения.

Используйте металлические прижимные пластины для герметизации устройства под давлением. Затем прикрепите Т-образный смеситель к входному отверстию устройства с помощью соответствующих фитингов. Теперь в кислотную линию стекают пять процентов адединовой кислоты со скоростью десять микролитров в минуту.

Затем пропустите 50-миллиметровый буфер аммониевой кислоты через белковую линию со скоростью один микролитр в минуту. Соедините устройство с передним концом модифицированного четырехугольного масс-спектрометра или масс-спектрометра Qtof, используя регулируемый изолированный столик для достижения оптимальных условий электрораспыления. После установки условий ESI-MS приобретите спектр, состоящий только из пепсина.

Затем введите от 50 до 100 микромолеров тау-белка, или фосфо-тау-белка, со скоростью один микролитр в минуту, там, где ранее протекал 50-миллиметровый буфер из ацетата аммония. После того, как система должна уравновеситься в течение не менее 10 минут, перед получением только белкового спектра. Пока течет белок Дао, или фосфо тао, введите оксид дутия со скоростью три микролитра в минуту через Т-разъем и дайте ему вступить в реакцию в кинетическом смесителе.

Чтобы увеличить время нанесения этикетки, вручную оттяните положение внутреннего стеклянного капилляра до достижения времени смешивания от 42 миллисекунд до восьми секунд, позволяя системе балансировать не менее 10 секунд между каждым оттягиванием. Эта анимация изображает рабочий процесс для типичного эксперимента. Белок выходит через выемку и смешивается с наступающим дутерием.

Обмен газогенов основного М8 происходит в течение отведенного времени реакции, которое можно варьировать, оттягивая белковый капилляр. Затем реакцию гасят, а затем расщепляют на микрофлюидной платформе, содержащей выходную иглу ESI. Полученный спектр содержит переваренный белок.

Процент поглощения дейтерия рассчитывается для отдельных пептидов, а затем отображается на трехмерную структуру белка. Профили разложения нативного и фосфо-тау были схожими, что дало покрытие последовательностей 77,1 и 71,7 процента соответственно, здесь показаны наиболее подходящие распределения изотопов и связанные с ними значения поглощения дейтерия для четырех простых пептидов. Наблюдаемый кинетический график зависимости процента поглощения дейтерия от времени для каждого пептида используется для извлечения наблюдаемой экспериментальной скорости.

Рассчитанные профили случайного качества показаны для сравнения и используются для извлечения теоретического внутреннего класса. Как и ожидалось, в диапазоне не наблюдалось факторов защиты, обычно связанных с вторичными структурными элементами, что подтверждает, что нативный тау демонстрирует слабую внутреннюю водородную связь. Значительная защита наблюдается на концах N и C, центральном домене и в областях агрегации.

При гиперфосфо-родственном тау наблюдалось общее увеличение поглощения дейтерия по всему белку. Наблюдается значительное увеличение на концах N и C, а также в области гексапептида 2. Степень факторов защиты окрашена в виде радужной схемы, как показано на рисунке.

После освоения этой техники ее можно сделать за несколько часов, если она выполнена правильно. При выполнении этой процедуры важно использовать области высокопроизводительного качества или выше, чтобы свести к минимуму загрязнения, поскольку они могут помешать анализу. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ковалентное мечение, химическое сшивывание, компьютерное моделирование и документальные исследования, чтобы сопоставить трехмерные структуры белка или подтвердить области взаимодействия белка белка и белка легина.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области структурной биологии для изучения внутренне неупорядоченных белков и доменов, наиболее распространенных при нуэродегенеративных заболеваниях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать электроаэрозольную ионизацию с временным разрешением, обмен водорода дейтерия, масс-спектрометрию, для изучения структуры и динамики белка.