Количественная оценка подвижности эндосомы и лизосом в культивируемых нейронах с помощью флуоресцентных зондов

Общая цель этого анализа визуализации — наблюдать за подвижностью везикул в нейронах и легко ее количественно оценить. Такой подход позволяет анализировать мембранный трафик в нейронах простым и эффективным по времени способом. Чтобы начать эту процедуру, переведите матку в новую чашку Петри с 70% этанолом.

Далее перенесите матку в другую чашку Петри с HBSS. Затем извлекают плод из матки с помощью стерилизованных рассекающих щипцов и хирургических ножниц. После этого поместите их в новую чашку Петри с HBSS.

Под стереомикроскопом удалите кожу и черепа, а также удалите мозг с помощью стерилизованных щипцов-рассекателей. Затем переложите их в другую чашку Петри с HBSS. Удалите мозговые оболочки с помощью стерилизованных рассекающих щипцов.

Затем обрежьте лишние регионы. Далее перенесите кору в новую чашку Петри с HBSS. Соберите все коры головного мозга с помощью одноразовой пипетки или пипетки объемом 25 миллилитров и поместите их в пробирку объемом 15 миллилитров.

После этого удалите HBSS с помощью пипетирования. Затем добавьте три миллилитра раствора фермента коры головного мозга в пробирку, содержащую кору головного мозга. Поместите трубку на водяную баню и выдерживайте ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.

После этого добавьте еще три миллилитра раствора коркового фермента головного мозга в пробирку, содержащую кору головного мозга, и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане еще пять минут. Через пять минут удалите раствор коркового фермента головного мозга и добавьте пять миллилитров DMEM, содержащего 10% фетальной бычьей сыворотки. Диссоциируйте кору головного мозга путем аккуратного пипетирования вверх и вниз с помощью пятимиллилитровой пипетки со стерильным наконечником P1000.

Затем снова пипетируйте кору головного мозга с помощью пятимиллилитровой пипетки с наконечником P200. Наденьте нейлоновое сетчатое фильтр 40 микрометров на 50-миллилитровую трубку и отфильтруйте суспензию, чтобы удалить мусор. Затем центрифугировать суспензию при 420-кратном g в течение пяти минут при комнатной температуре, а затем удалить среду DMEM.

После этого добавьте пять миллилитров среды для культуры коры головного мозга и аккуратно суспендируйте клеточную гранулу. Затем подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и отрегулируйте концентрацию клеток с помощью питательной среды коры головного мозга. Затем поместите три раза по 10 на шесть корковых нейронов в два миллилитра клеточной суспензии для каждой закодированной стеклянной нижней чашки объемом 35 миллилитров.

При этой процедуре смешайте четыре микрограмма плазмиды с 200 микролитрами среды, не содержащей сыворотки. В отдельной пробирке разведите восемь микролитров реагента для трансфекции в 200 микролитрах бессывороточной среды. Затем инкубируйте раствор в течение пяти минут при комнатной температуре.

Через пять минут смешайте раствор плазмиды и раствор реагента для трансфекции и выдержите смесь в течение 20 минут при комнатной температуре. После этого добавьте смесь в закодированное стеклянное дно посуды. Инкубируйте нейроны при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

После этого замените среду двумя миллилитрами питательной среды для коры головного мозга и инкубируйте нейроны при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух дней. Для получения изображений используйте флуоресцентный микроскоп, оснащенный ПЗС-камерой с объективом 40X. Поддерживайте температуру на уровне 37 градусов по Цельсию с помощью инкубационной системы.

Получайте нейронные изображения с точностью до одного кадра каждые пять секунд в течение 100-секундного периода, контролируемого программным обеспечением для получения изображений. Чтобы проанализировать изображения, откройте все последовательные изображения в программе ImageJ с ручным отслеживанием. Чтобы объединить последовательные изображения, выберите «Изображение», затем «Стопки», затем «Изображения для стопки» и нажмите OK. После этого выберите «Плагины», затем «Ручное отслеживание».

Появится всплывающее окно отслеживания. Нажмите на галочку в поле «Показать параметры» и определите параметры отслеживания в разделе «Параметры». Затем нажмите «Добавить дорожку», чтобы начать новую дорожку.

После определения интересующих пузырьков нажмите на центр сигналов на последовательных изображениях, чтобы записать координаты xy. Повторите эту процедуру, чтобы собрать координаты xy везикул из всех последовательных изображений, каждое изображение автоматически переходит к следующему изображению после выбора точки отсчета. На этом изображении показана подвижность LAMP-EGFP, содержащего везикулы в дендритах корковых нейронов мыши, после двух дней трансфекции, начатой при 4 DIV.

На врезке показано покадровое изображение положительных везикул LAMP-EGFP. Красная стрелка указывает на движущуюся везикулу, а синяя стрелка указывает на покоящийся пузырь. Оранжевые стрелки указывают на более высокие флуоресцентные сигналы.

Ниже приведено положение положительных везикул LAMP-EGFP по оси X в зависимости от времени. Везикула в красном круге, обозначенном b, движется, а пузырька в синем круге, обозначенном a, покоится. На этой гистограмме показано общее расстояние движения LAMP-EGFP.

И эта гистограмма показывает среднее расстояние подвижности LAMP-EGFP, содержащего везикулы.