Количественная оценка подвижности эндосомы и лизосом в культивируемых нейронах с помощью флуоресцентных зондов

Общая цель данного анализа изображений заключается в наблюдении за подвижностью везикул в нейронах и упрощении ее количественной оценки. Данный подход позволяет анализировать мембранный транспорт в нейронах простым и экономичным с точки зрения времени способом. Чтобы начать эту процедуру, перенесите матку в новую чашку Петри с 70% ethanol.

Затем перенесите матку в другую чашку Петри с HBSS. Затем извлеките плоды из матки с помощью стерильных dissecting forceps и хирургических ножниц. После этого поместите их в новую чашку Петри с HBSS.

Под стереомикроскопом удалите кожу и черепа, затем извлеките мозг с помощью стерильного dissecting forceps. После этого перенесите его в другую чашку Петри с HBSS. Удалите мозговые оболочки, используя стерильный dissecting forceps.

Затем отсеките лишние области. После этого перенесите кору в новую чашку Петри с HBSS. Соберите всю кору с помощью одноразовой пипетки или пипетки на 25 миллилитров и поместите ее в пробирку объемом 15 миллилитров.

После этого удалите HBSS с помощью пипетки. Затем добавьте в пробирку с корей три миллилитра раствора фермента для коры головного мозга. Поместите пробирку в водяную баню и инкубируйте при 37 °C в течение пяти минут.

После этого добавьте в пробирку с корей мозга еще 3 мл раствора фермента для коры головного мозга и инкубируйте их в водяной бане при 37 °C в течение дополнительных пяти минут. Через пять минут удалите раствор фермента для коры головного мозга и добавьте 5 мл среды DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Диссоциируйте кору, осторожно перемешивая содержимое путем пипетирования вверх-вниз с помощью 5-мл пипетки со стерильным наконечником P1000.

Затем снова пропипетируйте кору, используя пятимиллилитровый дозатор с наконечником P200. Установите нейлоновый клеточный фильтр с размером пор 40 µm на пробирку объемом 50 мл и профильтруйте суспензию для удаления клеточного дебриса. После этого центрифугируйте суспензию при 420 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре, а затем удалите среду DMEM.

После этого добавьте пять миллилитров среды для культивирования клеток коры головного мозга и осторожно ресуспендируйте осадок клеток. Затем подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и доведите концентрацию клеток до необходимого уровня, используя среду для культивирования клеток коры головного мозга. Далее высейте 3 × 10⁶ кортикальных нейронов в двух миллилитрах клеточной суспензии в каждую маркированную стеклянную чашку с плоским дном объемом 35 миллилитров.

В данной процедуре смешайте 4 µg плазмиды с 200 µL бессывороточной среды. В отдельной пробирке разведите 8 µL реагента для трансфекции в 200 µL бессывороточной среды. Затем инкубируйте раствор в течение пяти минут при комнатной температуре.

Через пять минут смешайте раствор плазмиды с раствором реагента для трансфекции и инкубируйте смесь в течение 20 минут при комнатной температуре. После этого добавьте смесь в кодированные чашки с стеклянным дном. Инкубируйте нейроны при 37 °C в течение 30 минут.

После этого замените среду на два миллилитра среды для культивирования клеток коры головного мозга и инкубируйте нейроны при 37 °C в течение одного-двух дней. Для визуализации используйте флуоресцентный микроскоп, оснащенный CCD-камерой и объективом 40X. Поддерживайте температуру 37 °C с помощью системы инкубации.

Выполните получение изображений нейронов с интервалом в один кадр каждые пять секунд в течение 100 секунд с помощью программного обеспечения для захвата изображений. Для анализа полученных данных откройте все последовательные изображения в программе ImageJ с установленным плагином Manual Tracking. Чтобы объединить последовательные изображения, выберите Image, затем Stacks, далее Images to Stack и нажмите OK. После этого выберите Plugins, а затем Manual Tracking.

Появится окно отслеживания (Tracking). Установите флажок «Show Parameters» и определите параметры отслеживания в разделе «Parameters». Затем нажмите «Add track», чтобы начать новое отслеживание.

После определения интересующих везикул нажмите в центр сигналов на последовательных изображениях, чтобы зафиксировать координаты xy. Повторяйте эту процедуру для сбора координат xy везикул на всех последовательных изображениях; каждое изображение автоматически сменяется следующим после выбора опорной точки. На данном изображении показана подвижность везикул, содержащих LAMP-EGFP, в дендритах кортикальных нейронов мыши через два дня после трансфекции, которая была начата на 4-й день DIV.

На вставке представлено изображение LAMP-EGFP-положительных везикул, полученное методом таймлапс-съемки. Красным наконечником стрелки отмечена движущаяся везикула, синим наконечником стрелки — покоящаяся везикула. Оранжевыми наконечниками стрелок indicated более интенсивные флуоресцентные сигналы.

Представлено изменение положения по оси X в зависимости от времени для положительных по LAMP-EGFP везикул. Везикула, обведенная красным кругом и обозначенная буквой b, находится в движении, а везикула, обведенная синим кругом и обозначенная буквой a, неподвижна. Данная столбчатая диаграмма отображает общее расстояние перемещения LAMP-EGFP.

На данной столбчатой диаграмме показано среднее расстояние перемещения везикул, содержащих LAMP-EGFP.