Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Общая цель данной экспериментальной стратегии заключается в определении различных функциональных ансамблей, в состав которых может входить белок, с помощью фракционирования аффинитивно очищенных белковых комплексов методом голубого нативного электрофореза в полиакриламидном геле и корреляционного профилирования с использованием масс-спектрометрии. Этот метод позволяет дополнить списки белков, полученные в ходе экспериментов по аффинной очистке с последующей масс-спектрометрией, информацией об их организации. Основными преимуществами данной процедуры являются простота выполнения, хорошее разрешение и тот факт, что она требует немногим больше усилий, чем традиционный метод гель-CMSMS.

Данный протокол оптимизирован для очистки белковых комплексов из 200–500 миллионов клеток, экспрессирующих эндогенные уровни белка с FLAG-тегом. После размораживания клеточного осадка, как описано в текстовом протоколе, добавьте к клеточной суспензии пять миллилитров ледяного лизирующего буфера, содержащего DTT и ингибиторы протеаз, и перемешайте круговыми движениями. Инкубируйте суспензию на льду в течение 10 минут.

Перенесите клеточную суспензию в охлажденный гомогенизатор. Лизируйте клетки, совершив от 20 до 30 движений плотно прилегающим пестиком до исчезновения заметной вязкости, затем перенесите гомогенат в охлажденные микроцентрифужные пробирки. После центрифугирования пробирок перенесите очищенный лизат в чистую охлажденную пробирку, оставив примерно 50 µL лизата.

Отберите аликвоту лизата объемом 35 µL для измерения концентрации белка и мониторинга очистки. Затем удалите буфер из предварительно подготовленных гранул. Ресуспендируйте гранулы в 1 mL лизата, после чего смешайте с остальным объемом лизата.

Инкубируйте смесь на ротаторе при температуре 4 °C в течение одного-двух часов. Соберите гранулы у стенки пробирки с помощью магнита. Отберите аликвоту супернатанта объемом 30 µL, остальное удалите.

Ресуспендируйте гранулы в 0,5 мл буфера IPP150, прокачивая содержимое пипеткой четыре-шесть раз. Затем перенесите суспензию в охлажденную пробирку объемом 1,5 мл. После этого трижды промойте гранулы 0,5 мл нативного буфера для элюции FLAG.

После последнего промывания перенесите гранулы в новую охлажденную пробирку. Тщательно удалите буфер. Ресуспендируйте гранулы в 100 µL раствора пептида 3X5 в концентрации 200 µg/mL в нативном буфере для элюции.

Затем инкубируйте при температуре 4 °C в течение 10 минут при осторожном вращении. Соберите гранулы с помощью магнита и перенесите супернатант в новую охлажденную пробирку. Повторите этот шаг дважды перед сбором всех элюатов.

Сконцентрируйте элюат до 25 µL в центрифужном фильтрующем устройстве путем центрифугирования при 10 000 ×g при температуре 4 °C. Подготовьте образец, добавив 4X буфер для нанесения нативных образцов и 0,5% добавку G-250 к 25 µL сконцентрированного элюата. Нанесите образец и нативные маркеры молекулярной массы, оставив между ними одну пустую лунку.

Затем внесите от 10 до 20 µL 1X нативного буфера для нанесения образцов во все пустые лунки. Осторожно заполните катодную камеру 200 mL 1X нативного темно-синего катодного буфера для PAGE, чтобы не потревожить образцы. Заполните анодную камеру 550 mL 1X нативного анодного буфера для PAGE.

Проводите электрофорез геля при напряжении 150 вольт в течение 30 минут. После остановки электрофореза удалите темно-синий катодный буфер с помощью серологической пипетки и замените его 1X светло-синим катодным буфером. Продолжите электрофорез еще в течение 60 минут, после чего откройте кассету с гелем и удалите одну из пластин кассеты.

Гель остается прикрепленным к другой пластине кассеты. Поместите гель в кювету с достаточным количеством фиксирующего раствора, чтобы он полностью покрывал образец, и инкубируйте в течение 30 минут при осторожном встряхивании. Затем удалите фиксирующий раствор и замените его водой перед сканированием геля.

Для подготовки к масс-спектрометрии сначала поместите 96-луночный планшет с коническим дном поверх другого 96-луночного планшета для сбора отходов. Проколите дно лунок 96-луночного планшета с коническим дном иглой 21 gauge. Затем добавьте в лунки проколотого планшета 200 µL 50% ацетонитрила и 0,25% муравьиной кислоты.

Инкубируйте стопку планшетов в шейкере в течение 10 минут. Затем центрифугируйте планшет при 500 ×g в течение одной минуты, чтобы жидкость стекла через отверстия в планшет для сбора отходов. После двукратного повторения этапов промывки заполните лунки перфорированного 96-луночного планшета 150 µL 50 мМ бикарбоната аммония.

Затем поместите гель на чистую поверхность. Разрежьте дорожку с образцом на 48 одинаковых сегментов. Разделите каждый сегмент на две или три части меньшего размера, за исключением пяти последних сегментов в верхней части геля.

Последовательно поместите каждый срез в лунку 96-луночного планшета с промытыми перфорированными днами. Добавьте в каждую лунку 50 µL ацетонитрила и инкубируйте планшет при перемешивании в течение 30–60 минут. После удаления жидкости путем центрифугирования добавьте в каждую лунку 200 µL 2 mM TSEB и 50 mM бикарбоната аммония.

Инкубируйте планшет при перемешивании в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего удалите жидкость путем центрифугирования, как описано ранее. Дегидратируйте фрагменты геля, добавив 200 microliters чистого ацетонитрила, и инкубируйте при перемешивании при комнатной температуре в течение 20 минут, пока фрагменты геля не станут белыми и непрозрачными. После удаления ацетонитрила добавьте в каждую лунку 150 microliters трипсина в холодном бикарбонате аммония.

Инкубируйте планшет с перемешиванием при 37 °C в течение двух часов. Затем поместите чистый планшет с коническим дном под планшет с гелем, соблюдая правильную ориентацию планшетов. После этого соберите жидкость, содержащую пептиды, путем центрифугирования при 200 ×g в течение одной минуты.

Поместите планшет с пептидами в центрифужный испаритель и выпарите жидкость, выполняя следующий шаг. Добавьте 150 µL 50% ацетонитрила с 0,25% муравьиной кислоты к фрагментам геля. Инкубируйте при перемешивании при 37 °C в течение 30 минут.

Соберите жидкость на частично высушенном планшете путем центрифугирования при 200 ×g в течение одной минуты. Продолжайте выпаривание планшета, содержащего пептиды, выполняя следующий шаг. Перенесите растворы пептидов в промытый планшет для центрифужного фильтрования.

Поместите под нее чистый планшет с коническим дном для сбора пептидов и центрифугируйте стопку планшетов, как описано ранее. Испаряйте жидкость в планшете с коническим дном до полного высыхания лунок. После высыхания планшет можно закрыть силиконовой крышкой и хранить при температуре minus 20 degrees Celsius до проведения масс-спектрометрии и анализа данных, как описано в текстовом протоколе.

Представительные результаты иерархической кластеризации профилей миграции белков Mta2 и соочищаемых белков при электрофорезе в нативном синем геле (blue native PAGE) представлены здесь в виде дендрограммы и тепловой карты интенсивности белков. Профиль миграции Mta2 демонстрирует два пика, что указывает на наличие двух различных комплексов. Некоторые субъединицы NuRD проявляют аналогичную закономерность с наибольшим содержанием в низкомолекулярном комплексе.

Напротив, другие субъединицы NuRD более представлены в NuRD-комплексе с более высокой молекулярной массой. С другой стороны, белок Cdk2ap1, взаимодействующий с Mta2, присутствует только в NuRD-комплексе с более высокой молекулярной массой. После освоения данная методика может быть выполнена за два с половиной дня.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости содержать все образцы и реагенты на льду, чтобы избежать диссоциации белковых комплексов. Эту процедуру можно применить к любому интересующему белку, при условии, что его можно извлечь из аффинной среды путем конкурентного элюирования в нативных условиях. После выполнения данной процедуры для валидации идентифицированных субкомплексов можно использовать другие методы, такие как обратная или последовательная коиммунопреципитация.