Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Общая цель этой экспериментальной стратегии состоит в том, чтобы определить различные функциональные сборки, в которые может быть вовлечен белок, с помощью синего нативного полиакриламидного геля, электрофореза, фракционирования аффинных очищенных белковых комплексов и корреляционного профилирования масс-спектрометрии. Этот метод может помочь добавить организационную информацию к спискам белков, полученным в экспериментах по массированной спектрометрии аффинной очистки. Основные преимущества данной процедуры заключаются в том, что она проста в выполнении, имеет хорошее разрешение, а также требует немного больше работы, чем обычные гелевые CMSMS.

Этот протокол оптимизирован для очистки белковых комплексов от 200 до 500 миллионов клеток, экспрессирующих эндогенные уровни белка, меченного FLAG. После размораживания клеточной гранулы, как описано в текстовом протоколе, добавьте в клеточную суспензию пять миллилитров ледяного буфера для лизиса, содержащего ДТТ и ингибиторы протеазы, и перемешайте. Выдержать суспензию на льду в течение 10 минут.

Перенесите клеточную суспензию в гомогенизатор холодного пуха. Лизируйте клетки с помощью от 20 до 30 ударов, используя плотный пестик до тех пор, пока не исчезнет заметная вязкость, затем перенесите гомогенат в холодные микроцентрифужные пробирки. После центрифугирования пробирок перенесите очищенный лизат в чистую холодную пробирку, оставив после себя примерно 50 микролитров лизата.

Сохраните 35 микролитров аликвоты лизата для измерения концентрации белка и контроля очистки. Далее снимаем буфер с заранее подготовленных бусин. Суспензируйте бусины с одним миллилитром лизата, а затем смешайте с остальным лизатом.

Инкубируйте смесь на вращающемся колесе при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного-двух часов. Соберите бусины на боковой стороне трубки с помощью магнита. Соберите 30 микролитров надосадочной жидкости и выбросьте остальное.

Ресуспендируйте шарики в 0,5 миллилитрах буфера IPP150 путем пипетирования от четырех до шести раз. Затем переложите суспензию в холодную трубку объемом 1,5 миллилитра. Далее трижды промойте бусины с 0,5 миллилитрами нативного буфера FLAG elution.

После последней промывки переложите бусины в новую холодную трубку. Тщательно снимите буфер. Ресуспендируйте гранулы в 100 микролитрах 200 микрограмм на миллилитр пептида 3X5 в нативном буфере для элюирования.

Затем инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут с мягким вращением. Соберите шарики с помощью магнита, и перенесите надосадочную жидкость в новую холодную трубку. Повторите этот шаг дважды, прежде чем вытянуть все элюаты.

Сконцентрируйте элюирование до 25 микролитров в центробежном фильтрующем блоке путем центрифугирования при температуре 10 000 раз G при четырех градусах Цельсия. Подготовьте образец, добавив в концентрированный элюат объемом 25 микролитров 4X нативный буфер загрузки образца и добавку для образца 0,5% G-250. Загрузите образец и маркеры нативной молекулярной массы, оставив между ними пустую лунку.

Затем загрузите от 10 до 20 микролитров нативного буфера для загрузки образцов 1X во все пустые лунки. Осторожно заполните катодную камеру 200 миллилитрами нативного темно-синего катодного буфера 1X PAGE, чтобы не потревожить образцы. Заполните анодную камеру 550 миллилитрами нативного анодного буфера 1X PAGE.

Запустите гель при напряжении 150 вольт в течение 30 минут. После остановки прогона извлеките темно-синий катодный буфер с помощью серологической пипетки и замените его светло-голубым катодным буфером 1X. Продолжая прогон в течение 60 минут, откройте гелевую кассету и выбросьте одну из кассетных пластин.

Гель остается прикрепленным к другой кассетной пластине. Поместите гель в лоток с достаточным количеством фиксирующего раствора, чтобы покрыть его, и выдерживайте в течение 30 минут, осторожно встряхивая. Затем удалите фиксирующий раствор и замените его водой перед сканированием геля.

Чтобы подготовиться к масс-спектрометрии, сначала поместите коническую нижнюю 96-луночную пластину поверх другой 96-луночной пластины для сбора отходов. Проткните дно лунок конической нижней 96 луночной пластины иглой 21 калибра. Затем добавьте 200 микролитров 50% ацетонитрила, 0,25% муравьиной кислоты в лунки пробитой пластины.

Выдержите тарелку стопкой в шейкере в течение 10 минут. Затем центрифугируйте пластину при 500 умноженных на G в течение одной минуты, чтобы жидкость стекала через отверстия в тарелку для сбора отходов. Повторив два раза этапы промывки, заполните лунки пробитой 96 луночной пластины 150 микролитрами 50 миллимолярного бикарбоната аммония.

Далее поместите гель на чистую поверхность. Разрежьте дорожку, содержащую образец, на 48 одинаковых ломтиков. Разрежьте каждый ломтик на две или три меньшие части, за исключением последних пяти ломтиков в верхней части геля.

Поместите каждый ломтик последовательно в одну лунку пробитого конца промытой 96 лункой пластины. Добавьте в каждую лунку по 50 микролитров ацетонитрила и выдержите тарелку с встряхиванием от 30 до 60 минут. После удаления жидкости центрифугированием добавьте в каждую лунку по 200 микролитров двухмиллиметрового ТСЭБ и 50 миллимолярного бикарбоната аммония.

Инкубируйте планшет с встряхиванием в течение 30 минут при комнатной температуре, прежде чем удалить жидкость центрифугированием, как и раньше. Обезвожьте кусочки геля, добавив 200 микролитров чистого ацетонитрила, и выдерживайте при встряхивании при комнатной температуре в течение 20 минут, пока кусочки геля не станут белыми и непрозрачными. После удаления ацетонитрила добавьте в каждую лунку по 150 микролитров трипсина в холодном бикарбонате аммония.

Выдерживайте тарелку с встряхиванием при 37 градусах Цельсия в течение двух часов. Затем поместите чистую коническую нижнюю пластину под пластину, содержащую гель, обеспечив правильную ориентацию пластин. Затем соберите жидкость, содержащую пептиды, центрифугированием при 200-кратном G в течение одной минуты.

Поместите пластину, содержащую пептиды, в центробежный испаритель и выпарите жидкость, выполняя следующий шаг. Добавьте в кусочки геля 150 микролитров 50% ацетонитрила, 0,25% муравьиной кислоты. Выдерживать с встряхиванием при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Соберите жидкость в частично высушенную пластину центрифугированием при 200-кратном G в течение одной минуты. Продолжайте испарять пластину, содержащую пептиды, выполняя следующий шаг. Перенесите пептидные растворы на промытую центробежную фильтрационную пластину.

Поместите под него чистую коническую нижнюю пластину для сбора пептидов и центрифугируйте стек планшетов, как и раньше. Выпаривайте жидкость в конической нижней пластине до полного высыхания лунок. После высыхания пластину можно накрыть силиконовой крышкой и хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия до проведения масс-спектрометрии и анализа данных, как описано в текстовом протоколе.

Репрезентативные результаты иерархической кластеризации профилей миграции Mta2 и коочищающих белков NATIVE PAGE представлены здесь в виде дендрограммы и тепловой карты, представляющей интенсивность белков. Миграционный профиль Mta2 показывает два пика, указывающих на два различных комплекса. Некоторые субъединицы NuRD демонстрируют аналогичную картину с наибольшим количеством в сборке с более низкой молекулярной массой.

Напротив, другие субъединицы NuRD более распространены в сборке NuRD с более высокой молекулярной массой. С другой стороны, Mta2-интерактив, Cdk2ap1, присутствует только в сборке NuRD с более высокой молекулярной массой. После освоения эту технику можно сделать за два с половиной дня.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что все образцы и реагенты должны находиться на льду, чтобы избежать диссоциации белковых комплексов. Эта процедура может быть применена к любому белку, представляющему интерес, при условии, что его можно рассматривать с аффинной среды путем конкурентного элюирования в нативных условиях. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как обратная или последовательная ко-иммунопреципитация для валидации идентифицированных субкомплексов.