Оптимизация и сравнительный анализ методов обогащения органической ДНК растений, подходящих для последующей последовательности следующего поколения

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы сравнить два метода, используемых для выделения высококачественной органеллярной ДНК, как пластидной, так и митохондриальной ДНК из ткани листьев растений, которая подходит для секвенирования следующего поколения. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы биологии растений, такие как степень органеллярного разнообразия среди таксонов и как изменения в последовательности или структуре органеллярного генома влияют на развитие и реакцию на стресс. Мы сравним два метода: метод дифференциального центрифугирования, который обогащает один конкретный тип органелл, и метод метафракционирования, который восстанавливает общую органеллярную ДНК из более мелких замороженных образцов тканей.

Стандартная процедура выращивания рассады пшеницы заключается в посадке семян в вермикулит, в квадратные горшки по четыре-шесть семян в углу. Перенесите горшки в теплицу с 16-часовым световым циклом. Поливайте растения каждый день.

Удобрите растения одной четвертью чайной ложки гранулированного удобрения 20-20-20 MPK после появления всходов, а затем через семь дней после появления всходов. Для наслаждения рассадой пшеницы высаживают семена и ухаживают за растениями как в стандартной процедуре. Но поместите горшки в темную камеру для роста.

Альтернативой выращиванию такой рассады в темной камере роста является накрытие растений в теплице, но с надлежащей вентиляцией. Первым шагом в этой процедуре является выделение органелл. Соберите пять граммов свежей ткани и промойте ее в холодной стерильной воде в охлажденном стакане на льду.

С помощью ножниц разрежьте ткань листа примерно на один сантиметр прямо в предварительно охлажденную 50-миллиметровую трубку, содержащую два керамических шлифовальных цилиндра. Держите образцы на льду на протяжении всей процедуры. Чтобы избежать перекрестного загрязнения, важно менять ножницы между образцами.

Отнесите образцы в вытяжной шкаф и добавьте 20 миллилитров STE-буфера в каждую 50-миллилитровую пробирку. Поместите образцы в предварительно охлажденные криогенные шлифовальные блоки в аппарате для измельчения тканей и измельчите образцы в течение 30 секунд со скоростью 1 750 оборотов в минуту. Поместите образцы на лед примерно на одну минуту.

Поворачивайте позиции образцов и измельчайте еще 30 секунд со скоростью 1 750 оборотов в минуту. Верните образцы в ведро со льдом. Для каждого образца вставьте воронку в чистую 50-миллилитровую трубку, помещенную в лед, и поместите в нее один слой фильтрующей ткани.

Предварительно смочите фильтрующую ткань пятью миллилитрами буфера STE и сохраните поток. Высыпьте гомогенизированную ткань в воронку. Промойте трубку для измельчения 15 миллилитров буфера STE, закройте и переверните трубку для промывки стенок и крышки и вылейте ее содержимое в воронку.

Осторожно удалите керамические камни, а затем отожмите и отожмите фильтрующую салфетку в воронку. Во избежание перекрестного загрязнения меняйте перчатки между образцами. Оберните крышки тюбиков парафиновой пленкой, чтобы избежать проливания.

Центрифуга при температуре 2 000 x G, при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем с помощью серологической пипетки осторожно отасуньте надосадочную жидкость, не нарушая гранулу, и поместите ее в высокоскоростную центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров с плотно уплотняющей прокладкой. Положите на весы небольшой стакан со льдом, разорвите весы и взвесьте каждую надосадочную жидкость.

Используйте буфер STE, чтобы сбалансировать пробирки с точностью до 0,1 грамма, а затем центрифугируйте при 18 000 x G при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Когда центрифугирование будет завершено, верните образцы в вытяжной шкаф и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте в гранулу один миллилитр буфера ST и аккуратно суспендируйте с помощью мягкой кисти.

Добавьте 24 миллилитра буфера ST, чтобы получить итоговый объем в 25 миллилитров. Аккуратно покрутите кисть в суспензии, чтобы перемешать, а затем нажмите на кисть на боковую сторону тюбика, чтобы удалить всю жидкость, прежде чем снимать кисть. После балансировки пробирок центрифугируйте при температуре 18 000 x G при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.

Во время центрифугирования приготовьте раствор ДНК 1, как описано в текстовом протоколе, и добавьте 200 микролитров в пробирку объемом 1,5 миллилитра на образец. Когда центрифугирование будет завершено, выбросьте надосадочную жидкость и промокните пробирку. В каждую высокоскоростную пробирку центрифуги добавьте 300 микролитров буфера STE и повторно суспендируйте гранулу с помощью мягкой кисти для рисования.

Поместите кисть в заранее подготовленный тюбик объемом 1,5 миллилитра, содержащий 200 микролитров раствора DNA-1, и покрутите кистью, чтобы удалить остатки гранул, застрявших в кисти. Нанесите пипеткой раствор DNA-1 в высокоскоростную центрифужную пробирку и аккуратно перемешайте. Оберните парафиновую пленку вокруг верхней части каждой трубки и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане в течение 30 минут.

Во время инкубации аккуратно перемешивайте путем закручивания. С помощью наконечника для пипетки с широким отверстием аккуратно извлеките смесь гранул из пробирки и поместите ее в пробирку с низким связыванием объемом 1,5 миллилитра. Добавьте 500 микролитров 400 миллимолярной ЭДТА, pH 8,0 в высокоскоростную центрифужную пробирку.

Аккуратно пипеткой, чтобы полностью удалить остатки гранул, и перенесите ЭДТА в трубку с низкой связываемостью, содержащую смесь гранул. Аккуратно перемешайте путем инверсии. Центрифуга при 18 000 x G, при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.

Впоследствии выбросьте надосадочную жидкость, промокните каждую пробирку и используйте гранулу сразу для выделения ДНК. В этом методе органеллярная ДНК обогащается из общей геномной ДНК, которая была экстрагирована с помощью коммерческих колонок для экстракции ДНК. Приготовьте необходимое количество магнитных шариков, связанных с белком MBD2 FC, в соответствии с инструкциями производителя и масштабируйте реакции, чтобы использовать от одного до двух микрограммов общей входной ДНК.

В этой демонстрации требуется 160 микролитров гранул для одного микрограмма общей входной ДНК. Чтобы захватить метилированную ядерную ДНК, добавьте один микрограмм входной ДНК в пробирку, содержащую 160 микролитров магнитных шариков, связанных MBD2, для каждого отдельного образца и аккуратно проводите пипеткой вверх и вниз с помощью наконечника с широким отверстием. Добавьте соответствующий объем 5x связывающего промывочного буфера для конечной концентрации 1x и пипеткой вверх и вниз с помощью широкого наконечника отверстия несколько раз перемешайте.

Вращайте трубки при комнатной температуре в течение 15 минут. Для успеха вытягивания вниз очень важно тщательно перемешивать бусины во время инкубации, особенно если наблюдается значительное комкование бусин. Чтобы предотвратить слипание шариков и обеспечить извлечение метилированной ДНК вниз, аккуратно пипетируйте образцы с помощью наконечника пипетки с широким отверстием и переворачивайте образцы два-три раза на протяжении инкубации.

Кратковременно вращайте трубки, содержащие смесь ДНК и магнитных шариков. Поместите трубки на магнитную решетку не менее чем на пять минут, чтобы собрать бусины сбоку от трубок. Раствор должен казаться прозрачным, он содержит неметилированную органеллярную обогащенную ДНК.

С помощью наконечников с широким отверстием осторожно удалите очищенную надосадочную жидкость, не потревожив шарики, и перенесите надосадочную жидкость в чистую двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку с низким связыванием. Храните образцы при температуре 20 или 80 градусов Цельсия. Для оценки относительной распространенности трех органеллоспецифичных импликонов в общей геномной ДНК и фракции органеллярной ДНК, полученной с помощью обоих методов, был использован метод острой ПЦР.

В целом, данные свидетельствуют о том, что метод дифференциального центрифугирования преимущественно обогащает митохондрии. Неметилированная фракция метилфракционированной общей геномной ДНК демонстрирует существенное обогащение обоих органеллярных импликонов. Процентное соотношение прочтений, сопоставленных с митохондриями или хлоропластами китайской пружины и референсными геномами культивируемой пшеницы Криса, согласуется с результатами количественной оценки (QPCR).

Дифференциальное центрифугирование дает ДНК, которая более обогащена митохондриальной ДНК, а метилфракционирование дает ДНК, которая, вероятно, отражает естественное изобилие двух органеллярных геномов. Этикетки для образцов, включая E, обозначают идиллированные образцы и NE обозначают неидиллированные образцы. Интересно, что идилляция не изменяла органеллярную численность.

В обоих методах теоретический охват митохондрий или геномов, на которые ссылаются хлоропласты, превышает 100-кратное покрытие, даже при атремультиплексировании 12 библиотек. Общая геномная ДНК мигрирует в виде диффузного мазка при постполевом гель-электрофорезе и превышает 50 килооснований. Ядерная фракция после метилфракционирования уменьшается в размерах, но остается сосредоточенной в районе 50 килооснований, что позволяет предположить, что метилфрактиоидированная ДНК наиболее подходит для длинного секвенирования.

После освоения оба метода экстракции органеллярной ДНК могут быть выполнены за один-два дня, от сбора образца до оценки конечного продукта, при правильном выполнении. Метод метилфракционирования имеет потенциал для значительного расширения диапазона исследований органеллярной ДНК до редких и сложных образцов, поскольку входные данные тканей чрезвычайно низки. Тем не менее, дифференциальное центрифугирование все еще может быть предпочтительным, когда для последующих исследований требуется только митохондриальная ДНК.

Аналогичным образом, этапы центрифугирования могут быть скорректированы таким образом, чтобы при желании предпочтительно извлекать пластидную ДНК. Оба метода экстракции органеллярной ДНК дают ДНК, пригодную для секвенирования следующего поколения, но метилфракционирование дает ДНК с высокой молекулярной скоростью, которая идеально подходит для длинного секвенирования.