Спектроскопия ЯМР как надежный инструмент для быстрой оценки липидного профиля рыбьего жира добавки
1 мая 2017 г.
Здесь, с высокой разрешающей способностью 1 Н и 13 С ЯМР (ЯМР) был использован в качестве быстрого и надежного инструмента для количественного и качественного анализа инкапсулированных добавок рыбьего жира.
Общая цель этого метода заключается в определении липидного профиля добавок рыбьего жира с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы для анализа липидов, такие как содержание липидов в добавках рыбьего жира и позиционное распределение различных жирных кислот на глицериновом скелете. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он делает возможным быстрый и надежный анализ нескольких различных молекул в одном снимке без использования этапов разделения и очистки.
Чтобы подготовить образцы для ЯМР-анализа протонов и углерода, сначала извлеките 120 микролитров, что составляет около 110 миллиграммов рыбьего жира, из пищевой капсулы с помощью шприца и поместите их в стеклянный флакон объемом 4 мл. Запишите вес рыбьего жира. Используйте 500 микролитров стокового раствора BHT, чтобы растворить 100 миллиграммов плюс-минус 10 миллиграммов рыбьего жира.
После растворения масла перелейте весь раствор непосредственно в высококачественную пятимиллиметровую ЯМР-трубку и прикрепите колпачок. Проанализируйте образцы в течение 24 часов после подготовки образцов. Вставьте трубку ЯМР в вращающуюся турбину.
Поместите спиннер и трубку на верхнюю часть градуированного глубиномера и осторожно надавите на верхнюю часть трубки, пока ее нижняя часть не коснется дна манометра. Затем поместите ЯМР-трубку на открытое место корпуса для образца. Запишите номер слота, в который помещен образец.
Чтобы загрузить образец в ЯМР-прибор, вернитесь к управляющему компьютеру и введите номер SX, где номер — это слот в корпусе образца, в котором хранится образец. Дождитесь появления на экране дейтериевого сигнала дейтерированного хлороформа. Как только сигнал дейтерия станет видимым, введите lock" в командной строке и выберите дейтерированный хлороформ из списка растворителей, чтобы заблокировать образец с помощью его дейтериевого резонанса.
Введите bsmsdisp"в командной строке, чтобы убедиться, что вращение не активно. Если кнопка вращения зеленого цвета, нажмите на нее, чтобы отключить вращение. После ввода команды new"чтобы создать новый набор данных, введите имя набора данных на вкладке name и номер эксперимента на вкладке номер эксперимента под названием EXPNO.
Используйте номер один на вкладке с номером процесса под названием PROCNO. Запишите название эксперимента на вкладке НАЗВАНИЕ. На вкладке Эксперимент нажмите Выбрать и выберите файл параметров C13IG.
Затем нажмите «Установить выбранный элемент в редакторе» и нажмите «ОК». Введите getprosol" в командной строке, чтобы получить стандартные параметры для текущего ЯМР-зонда и растворителя. Затем введите команду atma", чтобы выполнить автоматическую настройку и согласование зонда как для ядер углерода, так и для ядер протонов. Затем выполните одномерное градиентное шиммингирование для получения высокооднородного магнитного поля и, следовательно, оптимальной формы линии для сигналов ЯМР.
Для этого используйте стандартную автоматическую процедуру для 1D шимминга, просто последовательно выполнив команды qu topshim 1dfast ss; qu topshim tuneb ss; и qu topshim report" в командной строке. После оптимизации параметров, как описано в текстовом протоколе, получите одномерные углеродные ЯМР-спектры. Для этого перейдите к набору данных по углероду и используйте обратную последовательность импульсов с индустрированной развязкой, введя в командной строке pulprog zgig.
Введите команды в командной строке, чтобы настроить спектральный с nppm, центр радиочастотного передатчика, количество сканирований, количество фиктивных сканирований, количество точек данных и длительность импульса для угла импульса в девяносто градусов. Введите digmod baseopt" в командной строке, чтобы получить спектр с улучшенной базовой линией. Затем установите задержку релаксации в 60 секунд для прибора с частотой 850 мегагерц, набрав в командной строке di 60s.
Установите коэффициент усиления приемника на соответствующее значение с помощью команды "rga" для автоматического расчета коэффициента усиления приемника. Наконец, начните сбор данных, введя команду «Pulse Acquisition» в командной строке. Чтобы обработать данные, сначала введите si 64K" в командной строке, чтобы применить заполнение нулями и установить размер спектра рельса на 64K.
Затем установите параметр уширения строки на 1,0 герц, набрав lb 1,0"в командной строке, чтобы применить функцию ожидания с коэффициентом уширения линии 1,0 герц перед преобразованием 4ea. Выполните преобразование 4ea, набрав efp"в командной строке. Далее выполните автоматическую коррекцию фазы, набрав в командной строке команду apk.
Если для дальнейшего улучшения спектра требуется дополнительная регулировка фазы, перейдите на вкладку «Процесс». Затем нажмите на иконку «Настроить фазу» и «Коррекция фазы» для коррекции нулевого порядка и коррекции фазы первого порядка. Нажимая на иконки коррекции фазы нулевого порядка и первого порядка, перетаскивайте мышь до тех пор, пока все сигналы не перейдут в режим положительного поглощения.
Примените и сохраните значения фазовой коррекции, нажав кнопку «Возврат и сохранение», чтобы выйти из режима фазовой коррекции. Примените полиномиальную функцию четвертого порядка для коррекции базовой линии при интегрировании, введя команду abs n"в командной строке. Чтобы сообщить о химических сдвигах в ppm из TMS, увеличьте сигнал TMS, затем нажмите на значок «Калибровка» и поместите курсор с красной линией поверх сигнала ЯМР, на который нужно ссылаться, в данном случае TMS.
Чтобы настроить интенсивность порога, при необходимости используйте среднюю кнопку мыши. Щелкните левой кнопкой мыши и введите 0. При использовании BHT в качестве внутреннего стандарта интегрируйте пик в дельте 151,45, простираясь на пять герц с каждой стороны пика.
Затем установите интеграл равным микромолям BHT на 0,5 миллилитра стокового раствора. Интегрируйте пики интереса, простирающиеся на пять герц с каждой стороны пика. Если есть необходимость сосредоточиться на регионе, нажмите на значок выделения, чтобы отключить его.
Затем щелкните левой кнопкой мыши и перетащите, чтобы увеличить область. Нажмите на иконку выделения еще раз, чтобы активировать функцию интеграции и перейти к следующему пику. Щелкните левой кнопкой мыши и перетащите курсор через интеграл.
Нажмите кнопку «Вернуть регионы сохранения». Здесь показан репрезентативный спектр углеродного ЯМР-анализа в области карбонильного углерода. Показаны ЯМР-сигналы ЭПК и ДГК в положениях sn-1, 3 и sn-2.
Эти сигналы могут быть использованы для количественного определения ЭПК и ДГК. Здесь представлен репрезентативный спектр протонного ЯМР-анализа. Показаны ЯМР-сигналы ЭПК и ДГК, которые могут быть использованы для их определения.
Протонный ЯМР-спектр характеризуется более узкой спектральной шириной по сравнению с углеродным ЯМР-спектром и, следовательно, более низким спектральным разрешением. После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за 30 минут, если она выполнена правильно. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области липидного анализа к быстрому анализу различных липидных компонентов, которые появляются в многокомпонентных матрицах, таких как биологически активные добавки, растительное масло и биотопливо.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как применять протон и углерод, ЯМР-спектроскопию для анализа липидного профиля добавок рыбьего жира. Не забывайте, что работа с сильными магнитными полями, создаваемыми ЯМР-спектрометрами, может быть чрезвычайно опасной для кардиостимуляторов и хирургических протезов, а также для электронных устройств, таких как кредитные карты и часы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании демонстрируется применение спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения на ядрах 1H и 13C для анализа биологически активных добавок на основе рыбьего жира. Этот метод позволяет проводить как количественное, так и качественное профилирование липидов, предоставляя данные о составе и структуре жирных кислот.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Аналитическая химия
Теоретическое обоснование
- Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) является мощным аналитическим методом.
- Добавки с рыбьим жиром широко используются благодаря их полезным свойствам для здоровья.
- Понимание липидных профилей имеет решающее значение для нутрициологии.
- Позиционное распределение жирных кислот влияет на их биологическую функцию.
Цель исследования
- Определить липидный профиль добавок из рыбьего жира.
- Проанализировать содержание липидов и распределение жирных кислот.
- Предложить быстрый и надежный аналитический метод, не требующий длительной подготовки проб.
Используемые методы
- Экстракция рыбьего жира из пищевых капсул.
- Подготовка образцов для протонного и углеродного ЯМР-анализа.
- Использование стокового раствора BHT для растворения образцов.
- Взвешивание экстрагированного рыбьего жира для обеспечения точности анализа.
Основные результаты
- Успешное определение липидных профилей в добавках на основе рыбьего жира.
- Идентификация различных жирных кислот и их позиционного распределения.
- Демонстрация эффективности ЯМР-спектроскопии в анализе липидов.
- Представление данных о составе пищевых добавок.
Выводы
- ЯМР-спектроскопия эффективна для анализа добавок на основе рыбьего жира.
- Данный метод предоставляет ценную информацию для исследований в области нутрициологии.
- Значительным преимуществом является возможность проведения экспресс-анализа без этапов разделения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
ЯМР-спектроскопия позволяет проводить быстрый неразрушающий анализ липидного профиля добавок на основе рыбьего жира, что способствует контролю качества и принятию решений по составу при разработке нутрицевтиков. Метод обеспечивает получение количественных данных об основных жирных кислотах и их позиционном распределении без необходимости очистки, что сокращает сроки анализа. Эта возможность помогает на ранних этапах скрининга ингредиентов и оценки воспроизводимости от партии к партии для продуктов на основе омега-3.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет анализировать липидный состав для подтверждения механистических гипотез в исследованиях нутрицевтиков.
- Практическая ценность: Обеспечивает прямое профилирование липидов из сложных матриц без этапов экстракции или хроматографии.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает количественное определение профилей жирных кислот для стандартизации анализа при оценке добавок на основе липидов.
- Практическая ценность: позволяет подготовить систему к высокопроизводительному скринингу благодаря быстрому получению спектров 1H NMR менее чем за одну минуту.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает трансляционную преемственность путем установления связи между данными о структуре липидов и функциональными результатами в доклинических моделях.
- Практическая ценность: Способствует воспроизводимости липидного профилирования в процессе поиска новых соединений и в доклинических исследованиях с использованием стандартизированных протоколов ЯМР.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в рабочие процессы раннего поиска для анализа липидов, обеспечивая быстрое профилирование перед идентификацией ведущих соединений при разработке нутрицевтиков. Он способствует разработке анализов, предоставляя стабильные количественные данные о липидах без необходимости дериватизации. Данная методика расширяет возможности повторного использования в рамках предприятия в качестве стандартизированной аналитической платформы для составов, содержащих липиды.
- Биологические исследования: обеспечивает проверку гипотез относительно липидного состава и распределения жирных кислот в матрицах добавок.
- Скрининг: позволяет подготовить анализ за счет воспроизводимого количественного профилирования липидов с минимальной пробоподготовкой.
- Аналитика: обеспечивает прямые количественные измерения посредством интегрирования сигналов в спектрах 1H и 13C ЯМР для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает данные о структуре липидов с биологической значимостью путей разработки нутрицевтиков, не содержащих доксорубицин.
- Корпоративное использование: функционирует как масштабируемая, гибкая в выборе приборов платформа, применимая на системах ЯМР 500 MHz и 850 MHz для рутинного контроля качества.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при характеристике липидов за счет прямых количественных измерений методом ЯМР.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет использования внутреннего стандарта (BHT) и согласованного сбора спектров.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), позволяя быстро оценивать липидный профиль при скрининге рецептур.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации ингредиентов омега-3 с учетом рисков на основе верифицированных данных о составе.
Особенности реализации
- Требуется опыт интерпретации ЯМР-спектров и анализа сигналов липидов.
- Зависит от наличия доступа к ЯМР-спектрометрам (500 MHz или 850 MHz) и стандартным лабораторным расходным материалам.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов подготовки образцов, использования эталонов и интегрирования.
- При адаптации метода следует учитывать совместимость растворителей и выбор внутреннего стандарта для различных липидных матриц.
- Практические ограничения включают более длительное время сбора данных для 13C NMR по сравнению с 1H NMR, а также чувствительность к однородности магнитного поля.
